Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Создание двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG для ВИЧ-ассоциированного патогенеза печени
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Этот протокол обеспечивает надежный метод для создания гуманизированных мышей с иммунной системой человека и клетками печени. Двойной восстановленный иммунодефицитных мышей, достигнутых с помощью интраспелинической инъекции человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых клеток восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека-1 инфекции и повторение повреждения печени, как наблюдается в ВИЧ-инфицированных пациентов.
Transcript
Общая цель протокола заключается в создании гуманизированной модели мыши с функциональной иммунной системой человека и печенью с использованием человеческих гематопоэтических стволовых клеток и гепато сайта. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в генетической печени гуманизированных мышей. Этот метод является мощным инструментом для изучения иммунопатологии, вызванной ВИЧ, как наблюдается у людей.
Демонстрацией процесса будет Имин Сун, руководитель отдела патологии и микробиологии, а также Ваймин Ван и Эдврд Макаров, научный технолог. Для начала перенесите пуповинную кровь, собранную в гепаринизированных трубках, в стерильный ламинарный шкаф. Добавьте PBS до тех пор, пока объем не будет увеличен до 35 миллилитров.
Слой образца на вершине лимфоцитов разделения среды и центрифуги его 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 35 минут без перерывов. Далее, тщательно удалите верхний плазменный слой и используйте передачу пипетки для передачи белого баффи пальто интерфейс на новую трубку. Повторно приостанавливать баффи пальто в 30 до 40 миллилитров ледяного буфера.
Используя пипетки, смешайте 20 микролитров клеточной подвески с 20 микролитров 0,4%трипан синий. Pipette 10 микролитров этой смеси во внешнее отверстие любой из двух камер подсчета слайда, и вставить слайд в автоматизированный счетчик ячейки для подсчета клеток. Центрифуга клетки в 300 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Тщательно аспирировать супернатант и добавить 300 микролитров ледяного буфера. Добавьте 100 микролитров рецепторов ФК человека, блокирующих реагент, и 100 микролитров моноклональных мышей анти-человеческих антител CD34, спряженных MicroBeads для до 100 миллионов клеток. Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию.
Добавьте 10 миллилитров ледяного буфера для мытья клеток и центрифуги его 300 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в 500 микролитров ледяного буфера. После этого поместите положительный отбор колонки LS в магнитное активированное поле сортировки клеток и пройдите его с тремя миллилитров ледяного буфера.
Загрузите образец в колонку LS, которая может заманить MicroBeads, связанных с положительными клетками человека CD34 в образцах, и позволить ему течь под воздействием гравитации в трубку сбора. Вымойте колонку три раза с ледяным буфером и соберите элюент в той же трубке сбора. Затем окунитесь в колонку с пятью миллилитров ледяного буфера, чтобы узнать CD34 положительные клетки в новую трубку сбора.
Повторите процедуру для достижения чистоты более 90% Далее, используйте трипан синий краситель и гемоцитометр, чтобы подсчитать ускользать CD34 положительных клеток. После подсчета, центрифуга клеток на 300 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в 125 микролитров PBS для инъекции, которая будет использоваться немедленно в трансплантации.
Чтобы проверить чистоту положительного элюента CD34, возьмите 50 микролитров подвески и инкубировать его с 10 микролитров PE конъюгированных анти-человеческих антител CD34 при четырех градусах цельсия в течение 30 минут. После этого, мыть и повторно приостановить клетки в PBS и приступить к выполнять поток цитометрии. После приобретения проанализируйте данные, изложенные в текстовом протоколе.
Во-первых, извлекать и оттаивать криоконсервированные гепатоциты, как указано в текстовом протоколе. Затем удалите биокамерку и вылейте размороженые гепатоциты в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую разогретую оттаивание среды. Рок трубки вручную в течение нескольких секунд, чтобы приостановить клетки.
Пеллет клетки в 100 раз G и при комнатной температуре в течение восьми минут. Вымойте гранулы клеток в PBS с 0,1%BSA и объединить их либо со свежими или оттаяли ГЦП в PBS до конечного объема 80 микролитров на мышь. Во-первых, прикрепите один конец стерильной удлинительной трубки к игле 30 калибра, а другой конец к одному миллилитровому шприцу.
Заполните шприц с подвеской объединили HEPs и HSPCs. Fit шприц в паз повторяющихся дозатора и настроить дозатор для дозирования 10 микролитров в каждом прессе. Бритье каждой мыши, как указано в текстовом протоколе и скраб левой стороне тела каждой мыши с 10%povidone йода следуют 70%изопропил алкоголя.
Используя ножницы типа Vannas, сделайте небольшой разрез в коже, мышцах и брюшной полости слева от брюшной стенки, чтобы войти в брюшную полость примерно на 5 миллиметров ниже нижнего края грудной клетки. Найдите селезенку и используйте миппы, чтобы слегка вытащить ее в операционную зону для легкого доступа и вставить 30 калибровочных игл в нижний полюс селезенки. Затем разблокировать поршень дозатора пипетки и обойтись 10 микролитров объема в то время, с ограничением от 60 до 80 микролитров на селезенку.
Убирайте иглу медленно и клип селезенки с лигатирование клипы с помощью перевязки applier. Затем используйте хлопчатобумажные аппликаторы, смоченные стерильным PBS, чтобы подтолкнуть селезенку обратно в полость тела. Используйте прерванный узор шва, чтобы закрыть мышечный слой брюшной стенки.
Выполнить закрытие кожи с прерванной шов шаблон с использованием неаспасаемых швов. Перенесите все необходимые материалы на назначенный объект Уровня биобезопасности Two Plus. Носите личное защитное оборудование, включая одноразовую крышку все платья, бахилы, маску для лица и двойные перчатки, в том числе вырезать устойчивые перчатки, во все времена во время работы с вирусом.
Выберите мышей с восстановлением более 15% положительных клеток человека CD45 и с наличием человеческого альбумин в сыворотке крови для ВИЧ-1 инфекции. Интраперитонально вводят мышам от 1000 до 10 000 тканей культуры инфекционных доз 50 ВИЧ-1 ADA в объеме от 100 до 200 микролитров на мышь. После усыпания мышей, акциз печени с каждой мыши, как указано в текстовом протоколе.
Соберите и исправить печени в 4%paraformaldehyde ночь. Создание двойной гуманизированной модели мыши с человеческой печенью и иммунными клетками можно легко контролировать на каждом шагу с помощью очень простой цитометрии потока и потока, соответственно. Цитометрия потока регулярно проводится для оценки развития функциональной иммунной системы и для того, чтобы увидеть влияние ВИЧ-инфекции на иммунные клетки.
У двух гуманизированных мышей развитие функциональных иммунных клеток может варьироваться от 15 до 90% лимфоцитов. Для оценки engraftment человеческих гепатоцитов, ЭЛИЗА для человека конкретных уровней альбумин выполняется ежемесячно на сыворотке мыши. Мыши, притязаемые как ГСП, так и HEPs, показывают уровни альбулина, специфичные для человека, варья от примерно семи микрограмм на миллилитр до 377 микрограмм на миллилитр в течение одного месяца, продолжая расти с течением времени наблюдения.
Влияние ВИЧ-инфекции на иммунные клетки человека в крови двух гуманизированных мышей контролируется цитометрией потока и на HEPs в печени человеком-специфическим альбумином ELIZA. К пяти неделям ВИЧ-1 вызывает снижение уровня альбумин человека в сыворотке крови и истощение человека CK18 положительных гепатоцитов в печени разделов двойной гуманизированных мышей. Более низкое соотношение CD4 к CD8 обычно наблюдается в крови и печени ВИЧ-инфицированных мышей, по сравнению с уровнями, отмеченными в той же мыши перед инфекцией.
Кровь должна быть слоистых тщательно на верхней части лимфоцитов разделения среды для изоляции баффи пальто. Для операции осторожно удерживайте селезенку и вставьте иглу в нижний полюс селезенки. После изоляции гематопоэтических стволовых клеток, очень важно проверить чистоту CD34 положительных гематопоэтических стволовых клеток, чтобы избежать CD3 положительных клеток и острых инъекций гепатоцитов от различных доноров.
Как гуманизированных мышей показать физиологический аспект иммунной системы человека и печени, развитых мышей могут быть использованы для изучения физиопатогенеза ВИЧ и физических инфекций и цирроза печени.
Tags
Иммунология и инфекция Выпуск 151 Двойные гуманизированные мыши альбумин гепатоциты гуманизированная печень иммунная система человека вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) гематопоитические стволовые клетки гематопоитические клетки-предтекRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
