Etablering av dual Humanisert TK-NOG Mouse modell for HIV-assosiert Liver patogenesen

Det overordnede målet med protokollen er å generere en humanisert musemodell med funksjonelt menneskelig immunsystem og lever ved hjelp av humane hematopoetiske stamceller og hepato-området. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i genetisk lever humaniserte mus. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere immunopatologi forårsaket av HIV som observert hos mennesker.

Demonstrere prosessen vil være av Yimin Sun, en veileder fra patologi og mikrobiologi avdeling, sammen med Weimin Wang og Edwrd Makarov, forskning teknolog. For å begynne, overføre navlestreng blod samlet i hepariniserte rør til en steril laminær strømningskabinett. Legg til PBS til volumet økes til 35 milliliter.

Lag prøven på toppen av lymfocytt separasjonsmedium og sentrifuge det 400 ganger G og ved fire grader celsius i 35 minutter uten pauser. Deretter fjerner du forsiktig det øverste plasmalaget og bruker en overføringspipette til å overføre det hvite buffy coat-grensesnittet til et nytt rør. Re-suspendere buffy pels i 30 til 40 milliliter iskald buffer.

Bruk en pipette til å kombinere 20 mikroliter av cellefjæringen med 20 mikroliter på 0,4% trypan blå. Pipette 10 mikroliter av denne blandingen inn i den ytre åpningen av et av de to kamrene i et tellelysbilde, og sett lysbildet inn i en automatisert celleteller for å telle cellene. Sentrifuger cellene ved 300 ganger G og ved fire grader celsius i 10 minutter.

Aspirer forsiktig overnatanten og tilsett 300 mikroliter iskald buffer. Tilsett 100 mikroliter av humane FC reseptor blokkerer reagens og 100 mikroliter monoklonal mus anti-menneskelige CD34 antistoff konjugert MicroBeads for opptil 100 millioner celler. Inkuber i 30 minutter ved fire grader celsius.

Tilsett 10 milliliter iskald buffer for å vaske cellene og sentrifuge den 300 ganger G og fire grader celsius i 10 minutter. Fjern forsiktig det overnaturlige og re-suspendere pellet i 500 mikroliter iskald buffer. Etter dette plasserer du en positiv utvalg LS-kolonne i det magnetiske aktiverte cellesorteringsfeltet og sender den gjennom med tre milliliter iskald buffer.

Last prøven inn i LS-kolonnen som kan fange MicroBeads bundet til menneskelige CD34 positive celler i prøver, og la den strømme under tyngdekraftens påvirkning inn i oppsamlingsrøret. Vask kolonnen tre ganger med iskald buffer og samle eluent i samme oppsamlingsrør. Deretter stuper kolonnen med fem milliliter iskald buffer for å henfalle CD34-positive celler inn i et nytt oppsamlingsrør.

Gjenta prosedyren for å oppnå en renhet på over 90%Neste, bruk trypan blå fargestoff og et hemocytometer for å telle de unnsluppede CD34 positive cellene. Etter telling, sentrifuger cellene ved 300 ganger G i fem minutter. Kast de supernatante og re-suspendere cellene i 125 mikroliter pbs for en injeksjon som skal brukes umiddelbart i transplantasjon.

For å kontrollere renheten til CD34-positive eluent, ta 50 mikroliter av suspensjonen og inkubere den med 10 mikroliter PE konjugert anti-menneskelig CD34 antistoff ved fire grader celsius i 30 minutter. Etter dette, vask og re-suspendere cellene i PBS og fortsette å utføre flyt cytometri. Analyser dataene som beskrevet i tekstprotokollen etter anskaffelsen.

Først hente og tine de kryoserverte hepatocytter som beskrevet i tekstprotokollen. Fjern deretter biohetten og hell de tinte hepatocytter i et 50 milliliter konisk rør som inneholder oppvarmet tiningsmedium. Rock røret for hånd i noen sekunder for å suspendere cellene.

Pellet cellene ved 100 ganger G og ved romtemperatur i åtte minutter. Vask pelleted cellene i PBS med 0,1% BSA og pool dem med enten friske eller tinte HSPCer i PBS til et endelig volum på 80 mikroliter per mus. Først feste den ene enden av et sterilt forlengelsesrør til en 30 gauge nål og den andre enden til en en milliliter sprøyte.

Fyll sprøyten med suspensjon av samlede HEPer og HSPCer. Monter sprøyten i hakket på en repeterende dispenseringspipette og juster dispenseren for å dispensere 10 mikroliter i hvert trykk. Barber hver mus som beskrevet i tekstprotokollen og skrubb venstre side av kroppen til hver mus med 10% povidone jod fulgt 70% isopropylalkohol.

Ved hjelp av Vannas type saks, lage et lite snitt i huden, muskel og bukhinnen til venstre for bukhinnen veggen for å gå inn i bukhinnen ca 5 millimeter under den nedre kanten av ribbeburet. Finn milten og bruk tang til å trekke den litt til operasjonsområdet for enkel tilgang og sett 30 gauge nålen inn i den nedre polen av milten. Deretter låser du opp stempelet på dispenseringspipetten og dispenserer 10 mikroliter av volumet om gangen, med en grense på 60 til 80 mikroliter per milt.

Trekk nålen langsomt tilbake og klip milten med ligating klips ved hjelp av en ligation applier. Deretter bruker du bomullstippede applikatorer fuktet med steril PBS for å skyve milten tilbake i kroppshulen. Bruk et avbrutt suturmønster for å lukke muskellaget i bukveggen.

Oppnå hudlukking med et avbrutt suturmønster ved hjelp av ikke-absorberbare suturer. Overfør alt nødvendig materiale til et utpekt Biosafety Level Two Plus-anlegg. Bruk personlig beskyttelsesutstyr, inkludert et engangsdeksel alle kjole, skodeksler, en ansiktsmaske og doble hansker, inkludert kuttbestandige hansker, til enhver tid mens du arbeider med viruset.

Velg mus med en rekonstituering av mer enn 15 % av humane CD45-positive celler og med tilstedeværelse av humant albumin i serumet for HIV-1-infeksjon. Injiser musene intraperitoneally musene med 1000 til 10 000 vevskulturfeksiøse doser på 50 HIV-1 ADA i et volum på 100 til 200 mikroliter per mus. Etter euthanizing musene, avgiftsdirektoratet leveren fra hver mus som beskrevet i tekstprotokollen.

Samle og fikse leverene i 4% paraformaldehyd over natten. Etableringen av en dobbel humanisert musemodell med menneskelig lever og immunceller kan lett overvåkes på hvert trinn med svært enkle ELIZA og flytcytometri, henholdsvis. Flow cytometri utføres regelmessig for å evaluere utviklingen av et funksjonelt immunsystem og for å se effekten av HIV-infeksjon på immunceller.

I to humaniserte mus kan utviklingen av funksjonelle immunceller variere fra 15 til 90% av lymfocyttporten. For evalueringen av engraftment av menneskelige hepatocytter utføres ELIZA for menneskespesifikke albuminnivåer månedlig på museserum. Mus som er grafted med både HSPCer og HEPs viser menneskespesifikke albuminnivåer fra omtrent syv mikrogram per milliliter til 377 mikrogram per milliliter på en måned, og fortsetter å vokse over observasjonstiden.

Effekten av HIV-infeksjon på humane immunceller i blodet av to humaniserte mus overvåkes av strømningscytometri og på HEPs i leveren av menneskespesifikt albumin ELIZA. Etter fem uker forårsaker HIV-1 en reduksjon i humane albuminnivåer i serumet, og det er en uttømming av humane CK18 positive hepatocytter i leverdelene av to humaniserte mus. En lavere andel av forholdet mellom CD4 og CD8 er vanligvis observert i blodet og leveren av HIV-infiserte mus, sammenlignet med nivåer som er nevnt i samme mus før infeksjon.

Blod bør lagvises forsiktig på toppen av lymfocytt separasjonsmedium for isolasjoner av buffy pels. For operasjonen, hold milten forsiktig og sett nålen i nedre stang av milten. Etter isolering av hematopoetiske stamceller, er det avgjørende å sjekke renheten av CD34 positive hematopoetiske stamceller for å unngå CD3 positive celler og akutte injeksjoner av hepatocytter fra forskjellige donor.

Som humaniserte mus viser fysiologisk aspekt av humant immunsystem og lever, de utviklede musene kan benyttes til å studere fysipatogenese av HIV og fysiske infeksjoner og skrumplever.