Medicine
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细胞外通量分析仪分析原代培养小鼠新生心肌细胞的耗氧率
Chapters
Summary February 13th, 2019
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该方案的目的是说明如何使用小鼠新生儿心肌细胞作为一个模型系统, 以检查各种因素如何改变心脏的耗氧量。
Transcript
该协议允许我们分离和培养高双BBT，只有小鼠心肌细胞知道。为了评估线粒体功能，可以通过实际的银通量分析仪分析心肌细胞的耗氧率。该技术的优点之一是，心肌细胞的耗氧量可以轻松地以 96-well 格式以粘附状态测量，从而能够测试具有大量复制的多种条件。
该容器为心脏病学研究领域提供了重要的见解。除了耗氧，我们还可以研究其他代谢参数，如灰度和呼吸性环氧。实现心肌细胞的高变异性对于这个实验至关重要。
这需要有效的心脏消化。由于新生儿心肌细胞非常脆弱，温柔处理心肌细胞也很重要。在细胞培养罩中，将5ml的HBSS分到6井细胞培养板的每个井中，并放在冰上。
此外，将10ml的HPSS加入10cm细胞培养皿，然后在50ml无菌锥形管中准备20ml的尝试素消化液。将所有溶液放在冰上。接下来，提取心脏并立即转移到含有HBVS的无菌细胞培养皿。
去除任何残留的肺组织和较大的血管。用柔和的搅拌洗心。随后，用细剪刀将心脏切成8块，用钳子将心脏组织转移到HPSS的6井细胞培养板的一个井中。
使用 Moria 勺，在充满 HBSS 的 6 井板中，将其从井转移到井中，清洗心脏组织。然后将心脏组织转移到含有20ml Trypsin的锥形管中，并在4摄氏度的温和搅拌下孵育4小时。在这个过程中，在37摄氏度的水浴中预热胶原酶消化溶液。
将含有心脏组织和消化不良溶液的锥形管从4摄氏度转移到细胞培养罩。让心脏组织沉入管底，使用10ml血清移液器去除消化不良溶液。接下来，在管中加入10mlHS。
用HPSS重新吸收心脏组织2至3次，使用10ml血清移液器洗净尝试素。吸气HSS和添加10毫升预预热胶酶消化溶液到管与心脏组织。对于第一次消化，在37摄氏度的水浴中用心脏组织孵育管，10分钟不搅拌。
之后，将管子转移到细胞培养罩。使用 10ml 血清移液器轻轻重新吸收组织 10 次，使组织重新缝合。这将允许心脏分散，细胞从心脏组织释放。
让未消化的组织下沉。将富含心肌细胞的消化溶液转移到新的锥形管中，并立即添加同等数量的细胞培养基，以阻止胶原酶消化。然后加入10ml的胶原酶消化液到管中含有剩余的未消化的心脏组织。
对于第二次消化，在37摄氏度的水浴中用心脏组织孵育管，10分钟。重复第一次消化的过程，在停止胶原酶消化之前，将心肌细胞中丰富的消化溶液转移到新的锥形管中。接下来，将无菌细胞过滤器放在新的无菌 50ml 锥形管中。
用2至3ml细胞培养器预湿细胞过滤器，并通过细胞过滤器传递细胞。随后，用细胞培养培养剂冲洗细胞过滤器。然后，在180倍重力下，将含有心肌细胞的锥形管离心5分钟。
5分钟后，吸进上经剂，在10ml细胞培养培养中重新暂停细胞颗粒。将细胞板到10cm细胞培养盘上，孵育一小时。之后，轻轻搅动盘子。
用10ml血清移液器在培养皿上反复移液细胞培养培养，洗掉非粘附细胞，重新暂停细胞。然后，将非粘附细胞转移到一个新的10cm细胞培养皿中，再孵育一小时。一小时后，轻轻搅拌盘子，洗掉非粘附细胞。
将心肌细胞转移到新的50ml锥形管中。接下来，在96井细胞培养板的每个井中，通过等50微升的涂层溶液来准备一个96井培养板。如果存在气泡，请使用 20 微升移液器将其清除。
在 37 摄氏度下孵育板至少一小时，以便干燥基质涂层。然后，使用血细胞计计算细胞。将细胞板板到外细胞基质涂层96井细胞培养板，密度为每井1万至3万个细胞。
将细胞放在细胞中。要预制耗氧测定，请水合通量分析仪传感器盒至少 3 小时，在公用板的每个井中加入 200 微升的校准液。将传感器盒放回实用板，在 37 摄氏度内孵育，无需 CO2 或 O2 补充至少 3 小时。
在测定前一小时，轻轻取出细胞培养基，用200微升预预警线粒体应激测试培养基洗涤细胞两次。第二次洗涤后，加入175微升预预警线粒体应激测试介质。然后在37摄氏度下培养细胞，无需二氧化碳或补充氧气。
在线粒体压力测试介质中准备3ml的每个测试化合物。使用多通道移液器将每个化合物的 25 微升加载到传感器盒的喷油器端口中。细胞的状态和任何预处理可能影响注射未组联器FCCP导致的最大恢复。
细胞对非反应器的敏感性也会改变，因此，优化每个特定治疗的FCCP工作浓度至关重要。随后，建立细胞外通量测定协议并启动程序。首先，将传感器卡蒂里奇放入机器进行校准。
校准步骤完成后，更换检测板的校准器。如果需要，在检测后，使用多通道移液器小心丢弃所有检测介质。并且储存细胞培养球蛋白在负20摄氏度，以利用蛋白质测定进行未来的细胞正常化。
通过使用所述的规程，心脏从第0天新生儿幼崽分离，心肌细胞在96孔板中每孔10、20或3万个细胞的密度下播种。经过一夜培养，心肌细胞被发现很好地附着在涂层的塑料表面，并且很少有未连接的细胞。在这一点上，自发收缩心肌细胞很容易看到。
每井3万个细胞的种子密度在种子细胞扩散一天后出现汇合。心肌细胞在免疫上被免疫，并含有针对心肌细胞特异性标记物沙康α行为素的抗体。如这里所示，大多数细胞显示α作用素的正染色，表明心肌细胞分离的高纯度。
此处显示了一个典型的线粒体应激测试方案。线粒体压力测试从氧气消耗率的基准线测量开始，随后注射抑制 ATPA 的 Oligo myosin。然后，注射未联合剂FCCP，以测量最大耗氧率。
最后，随着两个电子传输复合抑制剂的注射，线粒体呼吸完全停止，OCR降至最低水平。获得一致且可重现的结果。实现高生存率至关重要。
因此，重要的是使用新生儿和轻轻处理心肌细胞的心脏组织。通过使用新的或现有的基因操纵的小鼠线，这种方法可以很容易地转化为数据，可能导致了解新的机制的生物能量调节在心脏。线粒体在心脏功能中起着关键的作用。
我们期望这种方法有助于识别新的调节剂和调节氧化代谢的通路，并找到治疗心力衰竭的新治疗靶点。
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