Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati
Chapters
Summary January 25th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol til at studere Patofysiologi af proliferativ diabetisk retinopati ved hjælp af patient-afledte, kirurgisk skåret ud, fibrovascular væv for tre-dimensionelle indfødte karakterisering og ex vivo vævskultur. Dette ex vivo kultur model er også modtagelig for afprøvning eller udvikle nye behandlinger.
Transcript
Diabetisk retinopati er den mest almindelige mikrovaskulære komplikation af diabetes. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om patofysiologi af slutstadiet sygdom proliferative diabetisk retinopati. Denne teknik gør det muligt at dekonstruktion af den indfødte tredimensionelle væv landskab og undersøgelse af væv patofysiologi i levende patientmateriale med direkte klinisk relevans. Se tekstprotokollen for nærmere oplysninger om operationen og den instrumentering, der anvendes i dissektionen. Til at begynde, sted fibrovaskulære væv, der er blevet fjernet fra forsøgspersoner gennemgår transkonjunctival mikroincision vitreoretinal kirurgi i en celle kultur fad, der indeholder sterile PBS. Ved hjælp af en opretstående dissektion stereo mikroskop, skære fibrovaskulære væv i cirka en kvadrat millimeter stykker. Nedsænk vævet i PBS og hold vævet på plads med mikrodissektion pincet. Gør klare nedskæringer i vævet med en steril skalpel, der sørger for at undgå at rive det fibrovaskulære væv. Placer hvert enkelt stykke væv i en brønd af en 12 brøndcellekulturplade, der indeholder en milliliter steril PBS. Først forberedes 25 mikroliter aliquots af fibrinogenopløsning ved stuetemperatur. Placer et stykke fibrovaskulær væv i midten af brønden af en 24 brøndplade og fjern overskydende PBS. Dernæst tilsættes 25 mikroliter TA-opløsning til en af de forberedte fibrinogen aliquots. Og ved hjælp af en anden pipette sat til 50 mikroliter blandes ved pipettering. Dispensere blandingen på det stykke fibrovaskulære væv og pipette op og ned for at sikre vævet stykke er indeholdt i dråben. Tidspunktet for fibrinogendannelse, der er kritisk for ex vivo-kulturens tredimensionalitet, testes i en tom dråbe, der er tidligere vævsindlejring som beskrevet i protokollen. Inkuber pladen i en cellekulturinkubator. Efter 30 til 60 minutter vippe pladen for at kontrollere, at fibrin gel er helt dannet. Dernæst overlejrer fibrovaskulære væv fibrin geler med ex vivo kultur medium suppleret med aprotinin. Derefter returneres kulturpladerne til cellekulturskuvøsen i den ønskede tidsperiode. Først erstatte ex vivo kultur medium med en milliliter paraformaldehyd løsning per brønd til at fastsætte kulturer. Efter en time skylles gelerne med tre fem minutters PBS-vask. Dernæst erstatte PBS vask med to milliliter natrium azide opløsning per brønd. Opbevar de faste geler ved fire grader Celsius.Brug en kvadratisk kantspatel i rustfrit stål til at løfte dråberne fra pladen omhyggeligt, startende ved kanterne, før du løfter midten af dråben. Ved hjælp af en rund kantet spatel overføre dråberne til individuelle brønde af en 12 brøndplade, der indeholder en milliliter PBS. Herefter vippes pladen på en støtte, og slip dråberne sættes på plads med en milliliter iskold acetone methanolopløsning i et minut. Skyl derefter med tre til fem to milliliter vasker af PBS. Centrifuge blokerende opløsning i 15 minutter for at fjerne snavs. Vip derefter pladen på en støtte og inkuber dråberne i 500 mikroliter af blokerende opløsning i to timer ved stuetemperatur. Forbered den primære antistofblanding i henhold til tekstprotokollen. Brug derefter en rund kantet spatel til at overføre dråberne til en rund bund 96 brøndplade. Der inkuberes dråberne i 30 mikroliter af primær antistofblanding pr. dråbe natten over ved fire grader celsius. Den næste dag overføres dråberne til en 12 brøndplade med to milliliter vaskeopløsning pr. brønd. Skyl dråberne med tre fem minutters vask. Vask derefter dråberne med ni 30-minutters vaske. Den følgende dag skylles dråberne tre gange med PBS. Forbered den relevante fluorophore-konjugerede sekundære antistofblanding i henhold til tekstprotokollen. Overfør dråberne til en rund bund 96 brøndplade, som tidligere påvist, og inkuber pladen med 30 mikroliter sekundær antistofblanding i fire timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.Efter fire timer overføres dråberne til en 12 brøndplade indeholdende to milliliter vaskeopløsning pr. brønd. Skyl først dråberne med tre fem minutters vask. Vask derefter dråberne med fire 30-minutters vaske. Den næste dag skylles dråberne fem gange med vaskeopløsning i 30 minutter og tre gange med PBS i 30 minutter. Den næste dag, overføre dråberne til en rund bund 96 brøndplade, som tidligere påvist. Kontrastain dråberne med Hoechst-atomplet i 30 minutter ved stuetemperatur. Slipningerne overføres til en 12 brøndplade med to milliliter PBS pr. brønd, og skyl tre gange med PBS. Dernæst anvende et smalt lag af hurtig hærdning montering medium langs kanterne af en firkantet dække glas og lad det tørre i et minut. Skyl derefter dråben ved at dyppe den i en brønd af en 12 brøndplade indeholdende deioniseret vand. Og overfør dråben til et mikroskopslid. Dernæst dispenseres 15 mikroliter af ikke-hærdende anti-fade monteringsmedium på dråben. Placer forsigtigt dækslets over dråben med monteringsmediet vendt mod diaset, og lad det falde til ro. Lad rutsjebanerne tørre i to timer ved stuetemperatur og opbevar dem ved fire grader Celsius natten over. Endelig billede dias med en opretstående epifluorescens mikroskop udstyret med en optisk sektionsfunktion på 20x eller 40x mål. I denne protokol fibrovaskulære væv blev udarbejdet og afbildet. De repræsentative data viste, at PDR ex vivo-kulturer fremkalder spiring af CD-31 positiv endotel- og vaskulaturbevarelse som reaktion på VEGFA. Omvendt har TGF
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
