Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Diyabetik retinopati diyabetin en sık görülen mikrovasküler komplikasyonudur. Bu yöntem, son dönem hastalığı proliferatif diyabetik retinopati patofizyolojisi ile ilgili anahtar soruların cevapsız yardımcı olabilir. Bu teknik, yerli üç boyutlu doku peyzaj yapısızlaştırma ve doğrudan klinik alaka ile canlı hasta materyalinde doku patofizyolojisi araştırılması sağlar. Ameliyat ve diseksiyonda kullanılan enstrümantasyon hakkında ayrıntılar için metin protokolüne bakın. Başlamak için, steril PBS içeren bir hücre kültürü çanak transkonjonktival mikroinsizyon vitreoretinal cerrahi geçiren insan deneklerden çıkarılan fibrovasküler doku yerleştirin. Dik bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak, yaklaşık bir milimetre kare parçalar halinde fibrovasküler doku kesti. PBS doku batırın ve mikro diseksiyon cımbız ile yerinde doku tutun. Fibrovasküler doku yırtılma önlemek için özen gösteren steril bir neşter ile dokuda net kesikler olun. Steril PBS bir mililitre içeren bir 12 kuyu hücre kültür plakası bir kuyu içine doku her bir parça yerleştirin. İlk olarak, oda sıcaklığında fibrinojen çözeltisi 25 mikrolitre aliquots hazırlayın. Bir 24 kuyu plaka kuyunun merkezine fibrovasküler doku bir parça yerleştirin ve herhangi bir fazla PBS kaldırın. Daha sonra, hazırlanan fibrinojen aliquots birine TA çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin. Ve başka bir pipet kullanarak 50 mikrolitre pipetleme ile karıştırın ayarlayın. Karışımı fibrovasküler doku ve pipet parçasına dağıtın ve doku parçasının damlacık içinde olduğundan emin olun. Ex vivo kültürünün üç boyutluluk için kritik fibrinojen oluşumu süresi, protokolde açıklandığı gibi boş bir damlacık önceki doku gömme test edilir. Bir hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka kuluçka. 30 ila 60 dakika sonra fibrin jeltamamen oluşmuş olup olmadığını kontrol etmek için plaka yıkın. Sonra, ex vivo kültür orta aprotinin ile desteklenen fibrovasküler doku fibrin jelleri bindirme. Bundan sonra, istenilen süre için hücre kültürü kuluçka için kültür plakaları iade. İlk olarak, kültürleri düzeltmek için iyi başına paraformaldehit çözeltisi bir mililitre ex vivo kültür ortamı değiştirin. Bir saat sonra, üç beş dakikalık PBS yıkayımı ile jelleri durula. Daha sonra, pbs yıkama yıkın ve her kuyuda iki mililitre sodyum azit çözeltisi ile değiştirin. Sabit jelleri dört santigrat derecede saklayın.Damlacık ların merkezini kaldırmadan önce kenarlardan başlayarak damlacıkları dikkatlice plakadan kaldırmak için paslanmaz çelik kare kenar spatula kullanın. Yuvarlak kenarlı spatula kullanarak pbs bir mililitre içeren 12 kuyu plaka bireysel kuyulara damlacıkları aktarın. Bundan sonra, bir destek plaka yatırın ve bir dakika boyunca buz gibi aseton metanol çözeltisi bir mililitre ile damlacıkları postfix. Daha sonra, PBS üç ila beş iki mililitre yıkıntı ile durulayın. Herhangi bir enkaz kaldırmak için 15 dakika boyunca engelleme çözeltisi santrifüj. Daha sonra, bir destek üzerine plaka yatırın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca engelleme çözeltisi 500 mikrolitre damlacıkları kuluçkaya yatırın. Ana antikor karışımını metin protokolüne göre hazırlayın. Sonra yuvarlak bir alt 96 iyi plaka damlacıkları aktarmak için yuvarlak kenarlı spatula kullanın. Damlacıkları bir gecede damlacık başına 30 mikrolitre birincil antikor karışımına 4 derece de inkübedin. Ertesi gün, damlacıkları kuyu başına iki mililitre yıkama çözeltisi içeren 12 kuyuluk plakasına aktarın. Damlacıkları üç beş dakikalık yıkıntılarla durula. Daha sonra damlacıkları 9 30 dakikalık yıkama ile yıkayın. Ertesi gün, pbs ile damlacıkları üç kez durulayın. Metin protokolüne uygun florofor konjuge sekonder antikor karışımını hazırlayın. Damlacıkları daha önce gösterildiği gibi yuvarlak bir alt 96 kuyu plakasına aktarın ve plakayı 30 mikrolitre ikincil antikor karışımıyla oda sıcaklığında ışıktan korunan dört saat kuluçkaya yatırın.Dört saat sonra, damlacıkları kuyu başına iki mililitre yıkama çözeltisi içeren 12 kuyuluk bir tabağa aktarın. İlk olarak, damlacıkları üç beş dakikalık yıkıntılarla durula. Daha sonra damlacıkları 30 dakikalık dört yıkama ile yıkayın. Ertesi gün damlacıkları 30 dakika yıkama solüsyonuyla beş kez, PBS ile ise 30 dakika durulayın. Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi, yuvarlak bir alt 96 iyi plaka damlacıkları aktarın. Oda sıcaklığında 30 dakika Hoechst nükleer leke ile damlacıkları karşı leke. Damlacıkları kuyu başına iki mililitre PBS içeren 12 kuyuplakasına aktarın ve PBS ile üç kez durulayın. Daha sonra, bir kare kapak cam kenarları boyunca hızlı sertleştirme montaj ortamı dar bir tabaka uygulayın ve bir dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra damlacığı deiyonize su içeren 12 kuyuluk bir kuyuya daldırarak durulayın. Ve damlacık’ı mikroskop slaytına aktarın. Daha sonra, damlacık üzerine sertleşmeyen 15 mikrolitre sertleşme önleyici montaj ortamı dağıtın. Kapak camı yavaşça damlacık üzerinde, montaj ortamı kaydıratekle bakacak şekilde yerleştirin ve yerleşmesine izin verin. Slaytlar oda sıcaklığında iki saat kuru ve bir gecede dört derece santigrat onları saklayın. Son olarak, 20x veya 40x hedefinde optik kesit fonksiyonu ile donatılmış dik epifloresan mikroskopile slaytları görüntüleyin. Bu protokolde fibrovasküler doku hazırlandı ve görüntülendi. Temsili veriler PDR ex vivo kültürlerin VEGFA yanıt olarak CD-31 pozitif endotel ve vaskülatür korunması filizlenme neden gösterdi. Tersine, TGF