Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Journal (Biochemistry)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Journal (Biochemistry)

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Click here for the English version

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Article DOI: 10.3791/59254-v

September 11th, 2019 •

Mikhail Skliar^1,2, Vasiliy S. Chernyshev^3,4

¹Department of Chemical Engineering, University of Utah, ²The Nano Institute of Utah, University of Utah, ³Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, ⁴Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 11th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

En trin-for-trin procedure er beskrevet for label-fri immobilisering af exosomer og ekstracellulære vesikler fra flydende prøver og deres billeddannelse ved atomkraften mikroskopi (AFM). AFM-billederne anvendes til at estimere størrelsen af vesikler i opløsningen og karakterisere andre biofysiske egenskaber.

Transcript

Denne protokol skitserer enkel forberedelse til AFM-billeddannelse af ekstracellulære vesikler i hydrerede og udtørrede former, deres elektrostatiske immobilisering, overfladescanning, vesical identifikation og dataanalyse og fortolkning. Den største fordel ved denne teknik er den bekvemme elektrostatiske fiksering af vesikler på hudens overflade og post billeddannelse analyse for at tage højde for form forvrængning forårsaget af immobilisering. De opnåede vesikler dimensioneringsresultater er i overensstemmelse med Gold Standard CryoTEM Imaging, som forbliver dyre og udfordrende teknik.

Hvis du er en ny AFM bruger, begynde med karakterisering af tørre prøver, før du fortsætter til hydreret prøver. Fordi der er mange yderligere faktorer, der kan påvirke hydreret prøve erhvervelse. Til at begynde, isolere ekstracellulære vesikler fra en bio-væske som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol.

Dernæst fastgør en glimmerskive fast på en magnetisk prøveskive i rustfrit stål. Kløve glimmer disken ved hjælp af en skarp barbermaskine til at udsætte et nyt lag af materiale. Ved stuetemperatur behandles glimmers overflade i ti sekunder med hundrede mikro-liter af en ti millimolar nikkel II kloridopløsning.

Dette ændrer overfladens ladning fra negativ til positiv. Blot nikkel II klorid opløsning med en fnug fri tør eller blotting papir. Vask derefter glimmeroverfladen tre gange med deioniseret vand og tør den med en strøm af tørt nitrogen.

Afm-prøveskiven anbringes med den vedlagte overflade, der er modificeret glimmer, i en petriskål. Dernæst fortyndes exosomerne med PBS for at opnå en koncentration mellem fire og 40 milliarder partikler pr. milliliter opløsning. Valider den fortyndede partikelkoncentration ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse.

Form en sessile dråbe på overfladen af glimmer ved at tømme hundrede mikroliter af den fortyndede exosole opløsning fra en pipette. Derefter placere låget på petriskålen og forsegle det med parafen film for at reducere prøve fordampning. Inkuberes i køleskabet i 12 timer.

Efter inkubation, aspirere 80 til 90 procent af prøven omhyggeligt uden at forstyrre overfladen. På dette tidspunkt vil exosomer være elektrostatisk immobiliseret på glimmer substrat. Når der skal afsendes hydrerede prøver, skylles overfladen tre gange med PBS.

Pas på at holde prøven hydreret under hele skylningsprocessen. Efter vask af glimmeroverfladen med PBS fjernes 80 til 90 % af væsken og pipettens 40 mikroliter af frisk PBS for at dække prøven. Den hydrerede prøve er klar til billedbehandling.

Når du billedker de udtørrede EV'er, fjernes saltene fra overfladen ved at skylle underlaget tre gange med deioniseret vand. Efter at have aspireret så meget væske som muligt, uden at røre overfladen, tør resten med en strøm af tørt nitrogen. For at afbilde de udtørrede ekstracellulære vesikler skal du vælge en cantilever, der er beregnet til scanning i luften ved at trykke på og være ikke-kontakt-billeddannelsestilstande, og montere den på sondeholderen.

Anskaf prøven på AFM-stadiet. Den magnetiske skive af rustfrit stål vil immobilisere prøven på scenen. Sæt sondeholderen i AFM.

Giv tid til præparatet og scenen til at ligevægte termisk. Brug tappetilstanden til at scanne et område, der er 5x5 mikron rastered i 512 linjer med en scanning sats på en hertz. Anskære både højde- og fasebillederne, da de giver gratis oplysninger om prøvens topografi og overfladeegenskaber.

Scanningstiden øges med et afbildet område og antallet af linjer, der er valgt til at danne billedet, men reduceres med scanningshastigheden. Da hurtige scanningshastigheder kan påvirke billedkvaliteten, bør hastigheden af rastering være en balance mellem anskaffelsestid og billedkvalitet. For at afbilde hydrerede vesikler skal du vælge en cantilever, der er egnet til scanning af bløde, hydrerede prøver, og monter cantilever på en sondeholder, der er designet til scanning i væsker.

Våd spidsen af cantilever med PBS at reducere sandsynligheden for at indføre luftbobler til væsken under scanning. Derefter immobilisere prøven på AFM fase. Når prøven termisk ækvilibrer, billede den hydrerede glimmer overflade i trykke tilstand.

Ansk af både højde- og fasebilleder. Hvis du vil analysere de billeder, der er taget, skal du først gå til Dataprocessens udvalgte SPM-tilstande efterfulgt af Tip', og vælg Modeltip'Vælg geometrien og dimensionerne på den spids, der bruges til at scanne prøven, og klik på OK'Ret tiperosionsartefakterne ved at udføre overfladerekonstruktionen. Åbn billedet.

I menuen skal du vælge Dataproces', og vælg derefter SPM-tilstande'efterfulgt af Tip', og vælg derefter Surface Reconstruction', og klik på OK'Næste, vælg Dataproces efterfulgt af Niveau', og vælg Planniveau'for at justere billedplanet og tilpasse laboratoriets XY-plan ved at fjerne hældningen i substratet fra scanningsdataene. Juster rækker i billedet ved at vælge Dataproces'efterfulgt af Correct Data', og vælg derefter Juster rækker'Flere justeringsindstillinger er tilgængelige, herunder median, som er en algoritme, der finder en gennemsnitlig højde for hver scanningslinje og trækker den fra dataene. Gå derefter til Dataproces'efterfulgt af Correct Data', og vælg Fjern ar'Dette fjerner almindelige scanningsfejl kaldet Scars'To align the glimmeroverfladen i nulhøjden, gå til menuen Dataproces og vælg Samkopier base'i menuen Level'drop down.

Identificer de ekstra cellulære vesikler på den scannede overflade ved at gå til Grains'menu og bruge Mark by Threshold'Denne algoritme identificerer overflade immobiliserede exosomer som partikler stikker ud fra nul overflade substrat ved højden over brugerens valgte tærskel. Vælg en tærskel i intervallet mellem et og tre nanometer. Dette vil fjerne det meste af ryggen jorden interferens.

Endelig udføre geometriske og dimensionelle karakterisering af de identificerede vesikler ved hjælp af de tilgængelige distributioner algoritmer tilgængelige fra Grains'menu. Eksporter AFM-data fra Gwyddion til specialiseret analyse af andre beregningsværktøjer og brugerdefinerede computerprogrammer. Den nikkelchlorid overflade modifikation resulterer i en immobilisering af ekstra cellulære vesikler, der er tid afhængig.

Overfladekoncentrationen af de immobiliserede vesikler er alt for tæt efter 24 timers inkubation, mens 12 timers inkubation fører til færre exosomer og scanne data, der er lettere at analysere præcist. Dette AFM billede viser hydreret MCF7 exosomer elektrostatisk immobiliseret på den modificerede glimmer overflade. Det tilsvarende AFM fasebillede bekræfter, at kornene i højdebilledet er bløde nanopartikler, som det bør forventes for membranblæsere.

Højdedataene for tre vesikler langs samme linje vises her. Disse profiler illustrerer en flad form forårsaget af den elektrostatiske tiltrækning af exosomer til den positivt lade overflade af den modificerede glimmer. Formen forvrængning er tydelig i et forstørret billede af den immobiliserede vesicle og dens tværsnit.

For at vurdere den kugleformede størrelse af exosomer i opløsningen, på kan matche de mængder, der er omgivet af overfladen immobiliseret og sfærisk membran kuverter. Størrelsesfordelingen af kugleformede vesikler i opløsningen blev bestemt ud fra AFM-data fra 561 immobiliserede vesikler. De vesicle størrelser i CryoTEM billeder er i overensstemmelse med AFM resultater.

Før du billedker hyrdrated exosomer, er det vigtigt at huske at grundigt skylle overfladen med PBS. Dette vil fjerne indgående exosomer og forhindre deres tilknytning til AFM tip. Når billeddannelse de udtørrede exosomer, skal du sørge for at bruge DI vand til at stige substratet.

DI vask vil forhindre dannelsen af salt krystaller på overfladen som substratet tørrer. Hvis til stede, vil salt krystaller gøre billedbehandling en vanskelig opgave.

X

Simple Hit Counter