Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Photoब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली आक्रामक तरह प्रेरित संरचनाओं में p62 टैग की गईं
Chapters
Summary March 26th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
हम लाइव कोशिकाओं के साथ photoब्लीचिंग प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के लिए एक व्यापक और व्यावहारिक प्रोटोकॉल का वर्णन. हालांकि प्रोटोकॉल में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था-p62 आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं में टैग की गईं, यह माइक्रोस्कोपी प्रणालियों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।
Transcript
फोटोब्लैचिंग, एफआरएपी प्रोटोकॉल के बाद मौजूदा फ्लोरेसेंस रिकवरी, या तो अधूरी या पीढ़ी जटिल हैं। इस वीडियो में प्रस्तुत प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है कि यह व्यापक, व्यावहारिक और सीधा है। इस एफआरएपी तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह जीवित कोशिकाओं में उपकोशिकीय डिब्बों के भीतर और बीच प्रोटीन गतिशीलता के मात्राकरण के लिए अनुमति देता है।
एफआरएपी का चिकित्सीय और नैदानिक दोनों उद्देश्यों के लिए अध्ययन किया जा रहा है। ऐसा ही एक उपयोग वीवो में विभिन्न ऊतकों में दवा वितरण प्रणालियों के भीतर प्रसार की मात्रा बताना है। यह जानकारी दवा संरचना और संरचना को अनुकूलित करने के लिए उपयोग की जा सकती है।
एफईआरएपी माइक्रोस्कोपी तकनीक ने क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर्दृष्टि प्रदान की है जिसमें प्रसार घटना को समझना रुचि का है। इनमें सेल और मॉलिक्यूलर बायोलॉजी, डेवलपमेंटल बायोलॉजी, न्यूरोसाइंस, मैटेरियल साइंस, एडवांस्ड बायोमैटेरियल्स और ड्रग डिस्कवरी शामिल हैं । यद्यपि वर्णित प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए है, अवधारणाओं को अन्य प्रणालियों, जैसे पौधे की कोशिकाओं, खमीर कोशिकाओं और बैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है।
एक व्यक्ति जिसने कभी भी इस तकनीक का प्रदर्शन नहीं किया है, वह इष्टतम छवि अधिग्रहण मापदंडों का निर्धारण करने, ब्याज का एक अधिग्रहण क्षेत्र बनाने में संघर्ष कर सकता है जो उनके प्रयोग के लिए उपयुक्त है, और मोबाइल अंश और वसूली के आधे समय की गणना कर सकता है। पहली बार इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, अपने प्रयोग के उद्देश्यों के संदर्भ में प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए कई प्रायोगिक प्रयोग करना सुनिश्चित करें। प्रक्रिया का प्रदर्शन Maleen Cabe, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन, और डेविड Rademacher, कोर इमेजिंग सुविधा प्रबंधक होगा ।
शुरू करने के लिए, वाईएफपी-पी62 संक्रमित RAW264.7 मैक्रोफेज की एक प्लेट तैयार करें, और उन्हें साथ पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित लिपोपोलिनासैकराइड के साथ व्यवहार करें। इसके बाद, एक बार बर्फ ठंडे टायरोड के बफर के साथ इलाज कोशिकाओं को कुल्ला। फिर, प्लेट में नोकोडाजोल-पूरक टायरोडे के बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें, और प्लेटों को एफआरएपी इमेजिंग और विश्लेषण से पहले 15 से 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
प्लेटों को FRAP इमेजिंग और विश्लेषण से पहले 15 से 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें । इमेजिंग सेटअप पर, आर्गन/2 लेजर की ५१४ नैनोमीटर लाइन का चयन करें, क्योंकि फ्लोरेसेंस मार्कर में ५१२ नैनोमीटर पर पीक एक्सट्रेशन है, और ५२७ नैनोमीटर पर पीक एमिशन है । इसके बाद, लेजर कंट्रोल विंडो में आर्गन/2, 458, 477, 488, 514 पर क्लिक करें और फिर स्टैंडबाय बटन पर क्लिक करें।
लेजर को गर्म करने के लिए लगभग तीन मिनट इंतजार करने के बाद, ऑन बटन पर क्लिक करें। फिर लेजर की लेजर शक्ति को 100% तक सेट करें और एंटर करें। इसके बाद, माइक्रोस्कोप पर लेजर लाइन का संचरण 5% तक सेट करें, प्लान-एपोक्रोमैट 63x आवर्धन 1.40 न्यूमेरिकल अपर्चर तेल उद्देश्य की ओर मुड़ें।
माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से नमूना देखें और देखने के क्षेत्र के केंद्र में एक एकत्रक की तरह प्रेरित संरचना रखें। फिर, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, फ्रेम आकार को 512 पिक्सल तक 512, स्कैन गति को आठ और डेटा गहराई को 12 बिट तक सेट करें। इसके अलावा एक को स्कैन औसत सेट, ऑप्टिकल ज़ूम तीन करने के लिए, और प्रेस दर्ज करें ।
इसके बाद, पिनहोल को 1.95 त्रुटि इकाइयों और डिटेक्टर लाभ को 582 तक से एसई करें, जो संतृप्ति के ठीक नीचे है। छवि अधिग्रहण के लिए ब्याज का एक वर्ग के आकार का क्षेत्र बनाएं, जिसमें आयाम 150 बाय 150 पिक्सल हैं। समय श्रृंखला ऐसी सेट करें कि ब्याज के क्षेत्र को हर 30 सेकंड में एक बार 35 बार स्कैन किया जाता है।
फिर, ब्लीच नियंत्रण सेट करें जैसे कि फोटोब्लैचिंग स्कैन नंबर पांच के बाद हो जाएगी, ब्याज के क्षेत्र की पांच प्रीब्लाच छवियों को इकट्ठा करने के लिए। पुष्टि करने के लिए दर्ज कुंजी दबाएं। इसके बाद, ब्लीच क्षेत्रों की खिड़की पर जाएं और आक्रामक-जैसे प्रेरित संरचना क्षेत्र के भीतर रुचि का एक गोलाकार आकार का ब्लीच क्षेत्र बनाएं, जिसका व्यास 10 पिक्सल है।
अब, पुनरावृत्तियों की संख्या 300 तक सेट करें, और फिर से एंटर कुंजी दबाएं। फिर, 100% बिजली के लिए लेजर लाइन सेट, और लेजर के लिए संचरण प्रतिशत क्षेत्र में 100 दर्ज करें, और प्रेस दर्ज करें। अंत में, बहाव के बारे में तीन माइक्रोन से कम के साथ 10 कोशिकाओं में 10 aggresome की तरह प्रेरित संरचनाओं से FRAP डेटा एकत्र करने के लिए छवि अधिग्रहण कार्यक्रम चलाते हैं ।
डेटा विश्लेषण शुरू करने के लिए, सबसे पहले डेटा विश्लेषण के लिए एआईएम एलएसएम फाइलों को व्यक्तिगत कंप्यूटर में स्थानांतरित करें। छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ प्रत्येक एआईएम एलएसएम फ़ाइल खोलकर ब्याज के अधिग्रहण क्षेत्र की समय श्रृंखला छवियों के ढेर को संरेखित या मिलान करके छवि बहाव के लिए सही। फिर, प्लगइन्स, पंजीकरण, स्टैकरेग और अनुवाद का चयन करें, इसके बाद प्लगइन्स, पंजीकरण, स्टैक्रेग और फिर कठोर शरीर का चयन करें।
इसके बाद, ब्याज के ब्लीच क्षेत्र में संकेत तीव्रता को मापने के लिए ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र की स्थापना की । इसके लिए ओवल टूल का चयन करें, फिर 10 पिक्सल व्यास के साथ ब्याज के ब्लीच क्षेत्र में एक सर्कल बनाएं और फिर ऐड बटन पर क्लिक करें। एक बार जोड़ा, ब्याज के नियंत्रण क्षेत्र में संकेत तीव्रता को मापने के लिए कार्यक्रम की स्थापना की ।
आयत उपकरण का चयन करें, फिर नियंत्रण क्षेत्र में 20 से 20 पिक्सल का एक वर्ग आकर्षित करें, और ऐड बटन पर क्लिक करें। अंत में, ब्याज की पृष्ठभूमि क्षेत्र में संकेत तीव्रता को मापने के लिए ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र की स्थापना की । आयत उपकरण का चयन करें, पृष्ठभूमि क्षेत्र में 20 पिक्सल द्वारा 20 का वर्ग आकर्षित करें, और फिर ऐड बटन पर क्लिक करें।
आरओआई प्रबंधक में विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्रों को जोड़ने के बाद, तदनुसार उन्हें ब्लीच आरओआई, कंट्रोल आरओआई और बैकग्राउंड आरओआई का नाम बदलें। प्रत्येक क्षेत्र में सिग्नल की तीव्रता को मापें। इसे पूरा करने के लिए, ब्लीच आरओआई, कंट्रोल आरओआई और बैकग्राउंड आरओआई का चयन करें, और फिर अधिक पर जाएं, और मल्टी उपाय का चयन करें।
परिणामों को क्रमशः ब्लीच आरओआई, कंट्रोल आरओआई और बैकग्राउंड आरओआई लेबल वाले कॉलम में स्प्रेडशीट पर चिपकाएं। ब्लीच आरओआई और कंट्रोल आरओआई में सिग्नल तीव्रता को सही करके पृष्ठभूमि से शुरू करें कॉलम लेबल वाले कॉलम में मूल्यों को घटाकर पृष्ठभूमि आरओआई लेबल किया गया है, और कॉलम लेबल नियंत्रण आरओआई। इन नए कॉलम को ब्लीच आरओआई और सही कंट्रोल आरओआई लेबल करें।
इसके बाद, ब्लीच आरओआई में सिग्नल को नियंत्रण आरओआई में पृष्ठभूमि-सही सिग्नल को सामान्य करें। कॉलम लेबल में मानों को विभाजित करें सही ब्लीच आरओआई को सही कंट्रोल आरओआई लेबल वाले कॉलम में मानों को विभाजित करें। इस नए कॉलम को लेबल करें, सामान्यीकृत सही ब्लीच आरओआई।
फिर, सामान्यीकृत सही ब्लीच आरओआई कॉलम में सिग्नल को ब्लीच आरओआई में पांच प्रीब्लाच मूल्यों के औसत से सामान्य करें। ब्लीच आरओआई में पांच प्रीब्लैच मूल्यों के औसत से सामान्यीकृत सही ब्लीच आरओआई लेबल वाले कॉलम में मानों को विभाजित करें। इस नए कॉलम को लेबल करें, सामान्यीकृत सही प्रीब्लाच एवरेज ब्लीच आरओआई।
अंत में, छवि प्रसंस्करण के लिए एक कार्यक्रम खोलें। वक्र पोस्टब्लाच सामान्यीकृत ब्लीच आरओआई मूल्यों और इसी समय मूल्यों की नकल करके सामान्यीकृत और सही ब्लीच आरओआई डेटा को फिट करें। उन्हें वक्र फिटर विंडो में चिपकाएं, कर्व फिटर ड्रॉपडाउन मेनू से घातीय वसूली का चयन करें, और फिट का चयन करें।
यहां दिखाया गया है RAW264.7 एलपीएस के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए फोटोब्लैचिंग के बाद फ्लोरेसेंस वसूली का एक ठेठ वीडियो है । ब्याज की पीड़ित तरह प्रेरित संरचना क्षेत्र के भीतर फ्लोरेसेंस वसूली धीमी है । यह प्रयोग p62 की गतिशीलता की डिग्री की जांच करने के लिए फोटोब्लैचिंग का उपयोग करता है।
अभेद्य जैसी प्रेरित संरचनाओं, प्रीब्लाच और पोस्टब्लाच में p62 फ्लोरेसेंस यहां दिखाया गया है। जैसा कि इस वीडियो में वर्णित है, फ्लोरेसेंस तीव्रता को समय के साथ ट्रैक किया जा सकता है। पृष्ठभूमि सुधार और सामान्यीकरण के बाद, p62 फ्लोरेसेंस की गणना मोबाइल अंश को 22% स्थिर अंश के रूप में 78% के रूप में करने के लिए की जा सकती है और 2.14 मिनट के रूप में, आक्रामक जैसी प्रेरित संरचनाओं के भीतर वसूली के आधे हिस्से का वर्णन करती है।
याद रखें, यह विशेष रूप से ब्याज के अधिग्रहण क्षेत्र को ठीक से परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि यह ब्याज की एक ALIS, ब्याज की एक नियंत्रण क्षेत्र, और ब्याज की एक पृष्ठभूमि क्षेत्र भी शामिल है । इस प्रक्रिया के बाद, अन्य मात्रात्मक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीकों को लागू किया जा सकता है, जैसे फोटोब्लैचिंग, फ्लिप और चयनात्मक फोटोब्लैचिंग में फ्लोरेसेंस लॉस। जबकि फ्लिप उपकोशिकीय डिब्बों के बीच निरंतरता और संचार की डिग्री को मापता है, चयनात्मक फोटोब्लैचिंग ऑर्गेनेल्स में प्रोटीन के सक्रिय और निष्क्रिय परिवहन के बारे में गतिज जानकारी प्रदान करता है, या प्रोटीन से भरपूर क्षेत्रों के बीच।
एफआरएपी को शुरू में कोशिका झिल्ली में प्रोटीन के पार्श्व आंदोलन की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था। बाद में, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के उपकोशिकीय डिब्बों के भीतर और बीच में प्रोटीन गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया है, जिसने शोधकर्ताओं के लिए कोशिका और आणविक जीव विज्ञान, विकासात्मक जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, सामग्री विज्ञान, उन्नत बायोमैटेरियल्स और दवा खोज सहित विभिन्न क्षेत्रों में सवालों के जवाब देने का मार्ग प्रशस्त किया ।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
