En konvergerende strategi for generering af et næsten Sekvenserede cDNA-bibliotek fra ikke-refererede stillehavsøsters

Det centrale spørgsmål, vi ønsker at tage fat på med denne metode, er, hvordan vi kan bruge RNA-prøver fra materiale, der er købt på lokale fødevaremarkeder til kloning af bioteknologisk relevante gener? Her bruger vi stillehavsøsters som et casestudie til at demonstrere denne tilgang og potentielle yderligere anvendelse. Den største fordel ved denne teknik er, at konventionel genom eller cDNA sekventering af østersprøverne kan omgås.

I stedet blev sekvenser af cytokrom c oxidase underenhed I og NADH dehydrogenase sammenlignet med offentligt tilgængelige referencesekvenser fra stillehavsøstersen for at vælge den mest nært beslægtede prøve. Den cDNA, der fremstilles ud fra denne prøve, kan anvendes direkte til kloning af bioteknologisk relevante gener, som kan vælges ved hjælp af oplysninger om offentlig sekvens. Demonstration af proceduren vil blive Yongmei Lyu og Yuquan Li, to kandidatstuderende fra Glycomics og Glycan Bioengineering Research Center på Nanjing Agricultural University.

For at forberede østers vævprøve, bruge en steriliseret skalpel til at skære ud ca 100 milligram homogent blødt væv fra den omtrentlige geometriske centrum af hver østers prøve. Prøven overføres til en mørtel fyldt med 50 milliliter flydende nitrogen. Grind den flash-frosne østersvæv i et fint pulver.

75 mg af hver prøves frosne væv vejes i et sterilt 1,5 millilitercentrifugerør, og der blandes med en milliliter guanidinium thiocyanat-phenolekstraktionsreageseage. Det mest kritiske trin i denne procedure er RNA-udvindingstrinnet. For at minimere RNA nedbrydning, er det vigtigt at reducere tiden mellem høst af østersvæv og RNA ekstraktion.

Centrifuge prøven ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliter centrifugerør, tilsæt 200 mikroliter chloroform, og bland grundigt på en vortex mixer i 10 til 15 sekunder, indtil blandingen bliver mælkehvid. Dernæst centrifuge i 15 minutter som gjort tidligere.

Med en pipette på 200 mikroliter overføres det øverste vandige lag forsigtigt uden at forstyrre interfasen til et nyt 1,5 milliliter centrifugerør. Der tilsættes 500 mikroliter isopropylalkohol i centrifugerøret, og inverteres forsigtigt for at blande prøverne. Lad derefter prøverne blive på is i 20 minutter.

Centrifuge ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i otte minutter, og fjern supernatanten. Pelletsuspendrer pelletet op i en milliliter 75 % ethanol og centrifugeres ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern alle supernatant, og gentag vask i ethanol.

Pillerne tørres i seks minutter ved stuetemperatur. Derefter opløses den tørrede RNA-pellet i 25 mikroliter DEPC-behandlet vand, og hold røret på is. Brug RNA-prøverne inden for 24 timer.

For at generere et cDNA-bibliotek skal du først forberede en reaktionsblanding for hver RNA-prøve i et 300-mikroliter-PCR-rør ved at tilføje løsninger i henhold til manuskriptet. Der tilsættes en mikroliter af den ekstraherede RNA-prøve i røret. Inkuber blandingen i en PCR termocyr i 60 minutter ved 42 grader Celsius, og derefter øge temperaturen til 95 grader Celsius i fem minutter.

Opbevar det genererede cDNA-bibliotek i op til 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Først tilsættes en mikroliter af det genererede cDNA-bibliotek til rør, der indeholder PCR-blandinger, der er udarbejdet i henhold til manuskriptet. Placer PCR-rørene i PCR-termokcymaneren, og udfør PCR-forstærkningen med et indledende denatureringstrin og 35 PCR-reaktionscyklusser bestående af et udglødningstrin, et forlængelsestrin og et denatureringstrin i henhold til manuskriptet.

Efter cyklusser, udføre en afsluttende forlængelse trin i fem minutter. Brug fem mikroliter af PCR-produktet til at kontrollere kvaliteten ved agarosegelelektroforese. Overhold det forstærkede COX1- eller ND-gen som et enkelt bånd på henholdsvis 759 eller 748 basepar.

For at rense resten af PCR-produktet tilsættes 100 mikroliter DNA-bindende buffer, der indeholder høje koncentrationer af chaotropic salte til hver prøve. Vortex kort at blande indholdet. Anbring en rensekolonne i et centrifugerør med to milliliter.

Pipette reaktionsblandingen i kolonnen. Røret anbringes med den monterede søjle i en centrifuge ved 14.000 gange g i et minut ved stuetemperatur. Efter at filtratet er kasseret fra centrifugerøret med to milliliter, vaskes der to gange med 700 og 400 mikroliter vaskeopløsning W2 ved centrifugering ved 14.000 gange g.

Dernæst varme en milliliter deioniseret vand til 65 grader Celsius i en metal blok varmelegeme. Overfør kolonnen til et nyt 1,5-milliliter centrifugerør, og pipette 25 mikroliter af det forvarmede deioniseret vand til midten af den hvide søjlemembran. Lad membranen suge i et minut ved stuetemperatur.

Derefter centrifuge rør med kolonnen på 14, 000 gange g i et minut ved stuetemperatur. Kassér kolonnen, og opbevar det rensede PCR-produkt i op til 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Valgfrit, COX1 eller ND omvendt primere kan også bruges til tovejs sekvensering.

Brug den relevante COX1- eller ND-fremadrettede primer til Sanger-sekvensering. Når sekvensresultaterne er hentet, sammenlignes sekvenserne med genomsekvensen af stillehavsøstersreferencestammen ved hjælp af onlineværktøjet NCBI Nucleotide BLAST. Brug respektive forreste og omvendte primere af MgUGD og MgUXS gener til at forstærke og rense ved PCR som gjort tidligere.

Efter inkubation af rensede PCR-produkter med fordøjelsesbuffer klargøres den præedigestede pET-30a-vektor ved at opløse 500 nanogram pET-30a i et 1,5 milliliter centrifugerør, og der tilsættes deioniseret vand til toppen op til 16 mikroliter. Derefter tilsættes to mikroliter af 10 gange koncentreret fordøjelsesbuffer og en mikroliter hver af de 20 enheder begrænsning endonucleaser Nde1 og Xho1 i røret. Inkuber blandingen ved 37 grader Celsius i tre timer.

Derefter tilsættes en mikroliter af en-enhed alkalisk fosfatase, og inkuberes ved 37 grader Celsius i en ekstra time. Derefter placere røret i en forvarmet metal blok varmelegeme ved 75 grader Celsius i 10 minutter for at inaktivere alkalisk fosfatase. Efter dyrkning E.coli BL21 celler bærer MgUGD og MgUXS gener, overføre kulturen i 400-milliliter LB medium i en to-liters rystekolbe, og læg den på en shaker ved 200 rpm ved en temperatur på 37 grader Celsius.

Efter tre timer kontrolleres den optiske tæthed på et fotometer ved en bølgelængde på 600 nanometer, og sørg for, at den når en absorption på ca. 0,5. Derefter reducere shaker temperatur til 20 grader Celsius. Der tilsættes 400 mikroliter af en-molar IPTG for at fremkalde ekspressionen af de rekombinante proteiner i tre timer.

Efter høst af cellerne, forstyrre cellerne ved sonikering i 20 minutter ved fire grader Celsius. Centrifuge ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i 20 minutter, og indsamle supernatant i et nyt rør til aktivitetstest. Efter aktivitetsanalysen skal reaktionerne slukkes ved at tilsætte 20 mikroliter methanol og 40 mikroliter chloroform til MgUXS- og MgUGD-blandingerne.

Vortex prøven blandinger, og centrifuge ved 14, 000 gange g i seks minutter og fire grader Celsius. Opsaml det øverste vandige lag af hvert rør i nye rør til MALDI-TOF massespektrometri. I dette eksperiment blev sekvensjusteringen af COX1- og ND-gensekvenserne af en meget divergerende prøve sammenlignet med referencen til stillehavsøsters.

De røde pile viser nukleotidforskelle mellem referencesekvensen og rækkefølgen af de opnåede cDNA-prøver. Sekvenserne af COX1- og ND-generne i en nært beslægtet østersprøve viser lav afvigelse fra referencen til stillehavsøstersstammen. MALDI-TOF massespektrometri viser en vellykket anvendelse af cDNA biblioteket til at klone de industrielt relevante gener MgUGD og MgUXS.

Gelbilledet identificerer også UDP-glucuronsyre og UDP-xylose genereret af enzymatisk virkning af den successivt udtrykte og rensede MgUGD og MgUXS. Denne metode kræver ikke et perfekt match mellem referencesekvensen og de opnåede markørsekvenser og bør give forskeren tillid til at arbejde med ureferenceerede østers. I princippet kan denne metode anvendes på enhver biologisk prøve, der ikke er afspejlet, og for hvilken sekvenser fra en nært beslægtet referenceart er offentligt tilgængelige.

Denne metode gør det muligt for ikke-sagkyndige forskere let at få adgang til genetisk materiale af potentiel biologisk betydning og baner vejen for, at flere forskere kan arbejde med let tilgængelige, men ufuldstændigt identificerede biologiske prøver.