Biology
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-Omics विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए चमगादड़ के ऊतक संग्रह
Chapters
Summary October 23rd, 2019
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यह जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक, और चमगादड़ के प्रोटीओमिक विश्लेषण के लिए इष्टतम ऊतक तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो जंगली में पकड़ा गया है। यह बल्ले पर कब्जा और विच्छेदन, ऊतक संरक्षण, और बल्ले ऊतक के सेल culturing के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल है.
Transcript
इस वीडियो में, हम एक मानवीय तरीके से चमगादड़ इकट्ठा करने के लिए कदम गाइड द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं, आबादी पर प्रभाव को कम करने और वैज्ञानिक मूल्य को अधिकतम करने का इरादा । हमारे दृष्टिकोण के फायदे यह हैं कि हम प्रत्येक चमगादड़ के लिए संभावित आणविक और रूपात्मक डेटा की मात्रा को अधिकतम करते हैं, ऊतकों को अपने भविष्य के मूल्य को बनाए रखने के लिए संरक्षित करते हैं, और जंगली व्यक्तियों की कटाई को कम करते हैं। विच्छेदन प्रोटोकॉल मौखिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं ।
ऊतक तैयारी तकनीकों के कई हम यहां मौजूद सबसे अच्छा कल्पना के माध्यम से सूचित कर रहे है कैसे विभिंन अंगों की पहचान कर रहे हैं, और फिर ठीक से विच्छेदन और संग्रहीत । देरी से बचने के लिए किसी भी विच्छेदन शुरू करने से पहले सभी शीशियों को तैयार करें। आरएनए के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक शीशियों की संख्या को अलग करें।
प्रत्येक ट्यूब को ऊतक प्रकार के साथ लेबल करें जो एकत्र किया जाएगा, साथ ही मानक नमूना पहचान जानकारी भी। शीशियों को भरें 50% आरएनए स्थिर समाधान से भरा है, और चार डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा। ध्यान रखें कि शीशियों को पूरी तरह से आरएनए स्थिर समाधान के साथ न भरें, क्योंकि इसे तरल नाइट्रोजन में रखते समय ट्यूब फट सकती है।
इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित बल्ले के नमूने का डेपुटेशन करें। त्वचा बालों से खोपड़ी, प्रावरणी, और खोपड़ी की मांसपेशियों, नाक पर त्वचा सहित। नाक के सामने के छोर को न तोड़ने का ध्यान रखें।
ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करने के लिए मजबूत पर्याप्त बल का उपयोग करके, संदंश के साथ आंखों को हटा दें। आरएनए स्थिर समाधान की एक दो मिलीलीटर शीशी में आंखों रखें। गर्दन से शुरू होने वाली खोपड़ी के पृष्ठीय हिस्से पर एक सैजिटल कट बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें, ध्यान रखें कि मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचाएं।
फिर, धीरे खोपड़ी के दोनों पक्षों को वापस खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें, जब तक कि यह मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खुला न फटा न जाए। सुनिश्चित करें कि कपाल के अंत की खोपड़ी को हटा दिया गया है, ताकि संदंश आसानी से मस्तिष्क को दूर कर सकें। धीरे-धीरे संदंश के साथ मस्तिष्क को परिमार्जन करें।
दिमाग बहुत नरम होगा। घ्राण बल्ब दिखाई देगा, खोपड़ी के इंटीरियर के वेंट्रल हिस्से पर बैठा होगा। घ्राण बल्ब को अटैच रखने की कोशिश करें।
यदि संभव हो, तो मस्तिष्क के आकार को बरकरार रखें, और इसे तुरंत सूखी बर्फ पर रखें, या आरएनए स्थिर समाधान की पांच मिलीलीटर शीशी में रखें। खोपड़ी के कौडल छोर पर अब कॉकलई को सिर के हर तरफ पार्श्व रूप से दिखाई देना चाहिए। धीरे-धीरे कॉकलाई खींचने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
फिर, उन्हें आरएनए स्थिर समाधान की एक दो मिलीलीटर शीशी में डाल दिया। ऊपर और नीचे जबड़े में शामिल होने के लिए दो चीरों बनाओ, और मंडीबल को हटा दें। क्रिब्रिफॉर्म प्लेट स्पष्ट हो जाएगी।
शोधकर्ता को उन्मुख रखने के लिए यह एक महत्वपूर्ण हड्डी है। इसे खोपड़ी के सबसे पूर्वकाल क्षेत्र के रूप में पहचाना जा सकता है, जिसमें कई फोरमेन होते हैं, और दो खांचे होते हैं जहां घ्राण बल्ब टिकी होती है। एक बार मंडीबल को हटा दिया गया है, तो खोपड़ी के शेष हिस्से से चबूतरा हटा दें।
सुनिश्चित करें कि जबड़े में क्रिब्रिफॉर्म प्लेट शामिल है। आरएनए स्थिर समाधान में नाक रखें, और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निचले मंडली से, कैंची के साथ जीभ काटें, और आरएनए स्थिर समाधान की दो मिलीलीटर शीशी में रखें।
आरएनए स्थिर समाधान में रात भर भिगोने के बाद तरल नाइट्रोजन में नाक की शीशी रखें। बर्फ पर भिगोने के 24 घंटे के बाद, या फ्रिज में, तरल नाइट्रोजन में नमूनों जगह है । पेट की गुहा के माध्यम से छेदने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, जिससे पसलियों तक एक देशांतर चीरा बना।
इससे कंकाल फ्रेम जब्त हो जाता है। छाती की मांसपेशी को प्रकट करने के लिए त्वचा को पट्टी करें, और मांसपेशियों के कम से कम दो नमूने लें। इन विच्छेदन के दौरान आरएनए और डीएनए दोनों के लिए ऊतक एकत्र किए जाते हैं।
उच्च आणविक वजन डीएनए के लिए ऊतकों को शुष्क क्रायोवियल में रखें, और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें। आरएनए स्थिर समाधान में आरएनए के लिए ऊतकों रखें। उरोस्थि के माध्यम से काटें, और पसलियों को दूर खींचें।
अब, फेफड़े और दिल को पुनः प्राप्त करें। फेफड़ों से दिल को अलग करने के लिए स्केलपेल और संदंश का उपयोग करें। फेफड़ों को तोड़ने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, और आरएनए स्थिर समाधान में रखें।
दिल ले लीजिए, जिसे पूरा लिया जा सकता है, लेकिन इसे आधा हिस्सों में विभाजित किया जाना चाहिए, ताकि आरएनए स्थिर समाधान अच्छी तरह से सोख सके। अब लिवर से सैंपल लें। लिवर के कम से कम दो सैंपल लें।
उच्च आणविक वजन डीएनए के लिए जमे रहने के लिए एक शीशी में एक नमूना रखें, और आरएनए स्थिर समाधान में दूसरे नमूने जगह है । अग्न्याशय और पित्ताशय को खोजने के लिए हेपेटिक डक्ट का पालन करें। आरएनए स्थिर समाधान की एक शीशी के लिए पित्ताशय स्थानांतरण।
पेट का पता लगाएं, और पंख की तरह यह आधार पर तिल्ली, बैंगनी की एक अलग छाया के रूप में प्रदर्शित होने । अग्न्याशय को भी यहां वजन संरचना के रूप में दिखाई देना चाहिए। आरएनए स्थिर समाधान की संबंधित शीशियों में पेट, तिल्ली और अग्न्याशय को इकट्ठा करें।
छोटी और बड़ी आंत के छोटे नमूने एकत्र करें। आरएनए स्थिर समाधान की संबंधित शीशियों में रखें। गुर्दे में से एक लें, और मूत्राशय के लिए उनकी नलिकाओं का पालन करें, फिर आरएनए स्थिर समाधान की संबंधित शीशियों में रखें।
यदि पुरुष, या गर्भाशय और अंडाशय यदि महिला है तो वृषण को खोजने के लिए एक गाइड के रूप में अन्य गुर्दे का उपयोग करें। यदि संभव हो तो एक या दोनों गोनाड एकत्र करें। इसके अलावा विंग की त्वचा के विभिन्न हिस्सों के नमूने लें, और अलग-अलग शीशियों में रखें।
हमारे दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें एक गैर घातक तरीके से जानवरों का नमूना करने के लिए अनुमति देता है, जबकि अभी भी जीनोमिक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री पैदा करने, साथ ही कार्यात्मक आणविक अध्ययन । हमारा प्रोटोकॉल विंग ऊतक से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट की तैयारी की अनुमति देता है। कोशिकाएं आनुवंशिक सामग्री के एक कीमती नवीकरणीय स्रोत के साथ-साथ चमगादड़ में कार्यात्मक और आणविक अन्वेषणों के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं।
लिखित प्रोटोकॉल की धारा छह के अनुसार ग्रोथ मीडिया में संरक्षित विंग क्लिप्स को टिश्यू कल्चर फैसिलिटी में ट्रांसफर किया जाना चाहिए । ट्यूब की सामग्री को 15 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस प्रदर्शन के लिए विंग झिल्ली बायोप्सी का उपयोग किया जाता है।
ग्रोथ मीडियम को सावधानी से निकाल दें। धीरे-धीरे बाँझ पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो बार बायोप्सी धोएं। ट्यूब में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेजनस चार के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।
इससे ऊतक का पाचन अलग-अलग कोशिकाओं में हो जाएगा। बिना आंदोलन के रात 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 2014 दूसरे दिन, एक नए सिरे से विकास माध्यम बनाओ, और यह ३७ डिग्री सेल्सियस को पूर्ववारम ।
इस्तेमाल की जाने वाली प्लेट के प्रत्येक कुएं में ताजा प्रीवार्म्ड ग्रोथ मीडियम के दो मिलीलीटर जोड़कर छह अच्छी तरह से टिश्यू कल्चर प्लेट तैयार करें। जरूरत होने तक इस प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में स्टोर करें। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब को हटा दें, और ताजा विकास माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़कर पाचन प्रतिक्रिया को बुझाएं।
एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए P1000 पिपेट टिप के साथ समाधान को सावधानीपूर्वक ट्रिट करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। धीरे-धीरे एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को 300 बार तीन मिनट के लिए स्पिन करें जी सुपरनेट को धीरे से एक P1000 पिपेट के साथ तरल के 80 से 90% को हटाकर त्यागें। प्रीवार्मेड ग्रोथ मीडियम के 500 माइक्रोलीटर में पैलेट को रीस्बल्ड करें।
यह सुनिश्चित करने के लिए निलंबन को धीरे-धीरे करें कि गोली अब दिखाई नहीं दे रही है, और कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से निलंबित कर दिया जाता है, जिससे ऊतक के छोटे टुकड़ों से बचना सुनिश्चित होता है जो अभी भी दीवारों पर दिखाई दे सकता है। धीरे से छह अच्छी तरह से थाली है कि पहले तैयार किया गया था की एक अच्छी तरह से सेल निलंबन की पूरी मात्रा पिपेट, prewarm विकास मीडिया युक्त । धीरे-धीरे प्लेट को एक ही परत में अच्छी तरह से सतह पर वितरित करने में मदद करने के लिए दो से तीन बार वापस करने के लिए पक्ष की ओर और सामने से रॉक करें।
एक माइक्रोस्कोप के नीचे चढ़ाया कोशिकाओं की जांच करें। वे एकल कोशिकाओं है कि ऊपर और तैर दिखाई देना चाहिए, लेकिन बहुत घने होना चाहिए । ध्यान से एक इनक्यूबेटर पूर्व निर्धारित में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के लिए थाली जगह है ।
लगभग 24 घंटे के बाद, संस्कृति के स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। कोशिकाओं को अब प्लेट की सतह से जोड़ा जाना चाहिए, और चपटा दिखाई देना चाहिए। कोशिकाओं को आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर प्रीसेट में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड में बनाए रखें।
मीडिया जलपान या बंटवारे की आवश्यकता को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं को देखा जाना चाहिए। जब भी आवश्यक हो, ध्यान से अच्छी तरह से माध्यम के लगभग 50% को एस्पिरेट करें, और धीरे-धीरे प्रीवार्म्ड विकास माध्यम के एक मिलीलीटर को अच्छी तरह से जोड़ दें, ताकि कोशिकाओं को परेशान न किया जा सके। जब कोशिकाओं को पारित करना आवश्यक हो, तो सावधानीपूर्वक विकास माध्यम के लगभग 90% को एस्पिरेट करें।
कोशिकाओं को अच्छी तरह से बाँझ पीबीएस के एक मिलीलीटर जोड़कर बहुत धीरे से धोएं, ताकि कोशिकाओं को परेशान न किया जा सके। धीरे-धीरे प्लेट को आगे-पीछे और साइड में दो से तीन बार रॉक करें। कोशिकाओं को फिर से धोने से पहले थाली से पीबीएस के सभी को ध्यान से आकांक्षी।
ट्रिप्सिन ईडीटीए को अच्छी तरह से जोड़ें, और धीरे-धीरे प्लेट को ट्रिप्सिन ईडीटीए के साथ अच्छी तरह से कवर करने के लिए रॉक करें, और कमरे के तापमान पर डेढ़ मिनट तक इनक्यूबेट करें। ताजा पूर्वनियोजित विकास माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाें। प्लेट की सतह से कोशिकाओं को धोने के लिए लगभग पांच बार ऊपर और नीचे पिपेट, और यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं निलंबन में हैं।
सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें, और 300 बार में तीन मिनट के लिए टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को स्पिन करें जी सुपरनेट को धीरे से एक P1000 पिपेट के साथ तरल का 80 से 90 प्रतिशत हटाकर त्यागें। पूर्व-युद्धाधित विकास माध्यम के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें, और निलंबन को धीरे-धीरे करें। सुनिश्चित करें कि गोली या गोली के बड़े टुकड़े अब दिखाई नहीं दे रहे हैं, और कोशिकाओं को एक ही सेल निलंबन में हैं।
एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल गिनती करने के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ एक से एक को निलंबित कोशिकाओं के दस माइक्रोलीटर एलिकोट मिलाएं। एक मिनट के लिए इनक्यूबेट, और गिनती स्लाइड पर समाधान के 10 माइक्रोलीटर पिपेट। उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर में गिनती स्लाइड डालें।
10% DMSO की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए DMSO के साथ विकास माध्यम के संयोजन से फ्रीजिंग मीडिया तैयार करें। गोली एक छह अच्छी तरह से थाली के एक ८० से ९०% confluent अच्छी तरह से तैयार किया जाना चाहिए । पैलेट को फ्रीजिंग मीडियम के डेढ़ मिलीलीटर में रिस्पेंड करें।
दो अलग-अलग क्रायोवियल्स में से प्रत्येक में सेल निलंबन के लगभग 750 माइक्रोलीटर रखें। शीशियों को क्रायोजेनिक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें, ताकि कोशिकाओं को कोशिका जीवन शक्ति बनाए रखने के लिए धीरे-धीरे फ्रीज करें। तुरंत उन्हें माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
जमे हुए कोशिकाओं को गलने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से प्रीवार्म्ड विकास माध्यम के दो मिलीलीटर युक्त एक छह अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें जिसका उपयोग किया जाएगा। जरूरत तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में प्लेट बनाए रखें। तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं की एक शीशी लें, और कोशिकाओं को तेजी से पिघलाने के लिए इसे गर्म पानी के स्नान में रखें।
इसमें दो से तीन मिनट का समय लगना चाहिए। जैसे ही शीशी में समाधान गल गया है, धीरे-धीरे समाधान को समरूप बनाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, और तुरंत पूरे समाधान को छह अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में रखें। धीरे-धीरे प्लेट को एक ही परत में अच्छी तरह से सतह पर वितरित करने में मदद करने के लिए दो से तीन बार वापस करने के लिए पक्ष की ओर और सामने से रॉक करें।
इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और पांच प्रतिशत कार्बन डाई ऑक्साइड को 24 से 48 घंटे के लिए रखें। निगरानी और प्रदर्शन के रूप में कोशिकाओं को पारित करने। डीएनए निष्कर्षण के प्रतिनिधि परिणाम तीन चमगादड़ प्रजातियों से मानक डीएनए विश्लेषण के लिए दिखाए जाते हैं ।
एक भी बड़ा बैंड प्रत्येक संबंधित निष्कर्षण से डीएनए के न्यूनतम विखंडन, और समान आकार के टुकड़ों को इंगित करता है। आरएनए निष्कर्षण के लिए सफलता का एक आम संकेतक आरएनए अखंडता संख्या, या आरआईआर है, जिसमें आठ से ऊपर मूल्य हैं जो आरएनए में उच्च गुणवत्ता का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां दिखाया गया है 13 विभिन्न ऊतक प्रकार के नियोट्रॉपिकल बैट प्रजातियों से आरएनए अर्क के आरआईआईएन मूल्य हैं, जिन्हें चार अलग-अलग इलाकों में नमूना दिया गया है।
एंडीज, कोस्टा रिका और डोमिनिकन गणराज्य में प्रजातियों से नमूना ऊतकों को रात चार डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्थिर समाधान में भिगोने के बाद सीधे तरल नाइट्रोजन में रखा गया था । अमेज़न में प्रजातियों से नमूना ऊतकों तरल नाइट्रोजन में लगभग एक सप्ताह के एक आरएनए स्थिर समाधान रखने के बाद रखा गया था, और चार डिग्री सेल्सियस लगातार पर रखा । यहां तक कि ऐसे मामलों में, आरआईएन मूल्यों को तुरंत आरएनए स्थिर समाधान में रखा गया था, और सीधे तरल नाइट्रोजन में।
ऊतक संस्कृति के बाद, चमगादड़ सेल संस्कृतियों को प्लेट सतह के 80 से 90% को कवर करना चाहिए, और उनके मूल आकृति विज्ञान को बनाए रखना चाहिए। यह बंटवारे के लिए इष्टतम चरण का प्रतिनिधित्व करता है। छह से अधिक मार्गों के बाद, कोशिकाएं बड़े और लंबे समय तक बनने के लिए अपनी आकृति विज्ञान को बदल देंगी, और कोशिकाएं सेनेसेंस में प्रवेश करेंगी।
चमकीली कोशिकाएं मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। संस्कृति में कोशिकाएं डीएनए, आरएनए और प्रोटीन जैसी सामग्री के नवीकरणीय स्रोत का प्रतिनिधित्व करती हैं। इन सेल लाइनों को फ्रीज किया जा सकता है, इस प्रकार एक संसाधन प्रदान करना जो कई वर्षों के शोध में उपयोग किया जा सकता है।
यह जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टॉमिक और कार्यात्मक अध्ययनों की अनुमति देता है जो प्राथमिक ऊतकों का उपयोग करके चुनौतीपूर्ण होंगे। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से या रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि सेलुलर फेनोटाइप पर प्रभाव का निरीक्षण किया जा सके।
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