Genetics
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CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन
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Summary June 20th, 2019
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यहाँ प्रस्तुत कुशल CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ जीन संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल है स्तनधारी कोशिकाओं में ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर.
Transcript
कोशिकाओं में Cas9 तत्वों को सुरक्षित और प्रभावी ढंग से वितरित करना जीन संपादन आधारित उपचारों के लिए महत्वपूर्ण है। हम यहां जो प्रोटोकॉल दिखाते हैं, उस दिशा में एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं । प्रोटोकॉल ट्यूब इलेक्ट्रोपॉरेशन नामक एक नई इलेक्ट्रोपाउरेशन विधि का उपयोग करता है।
यह उच्च सेलुलर जीवित रहने की दर के साथ ही जीन संपादन दरों की ओर जाता है । ट्यूब इलेक्ट्रोपॉनेशन विधि वायरस, दवा, और रिपोर्टर संवर्धन मुक्त है। इन्हें नैदानिक अनुप्रयोगों में पसंद किया जाता है, इसलिए जीन संपादन आधारित उपचारों के साथ।
विधि सार्वभौमिक रूप से कई सेल प्रकारों पर लागू होती है। उदाहरण के लिए मानव हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं, प्राथमिक टी कोशिकाओं, और अन्य कोशिकाओं सभी हमारी विधि का उपयोग कर संपादित किया जा सकता है। यह ट्यूब इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि एक पतली ट्यूब का उपयोग करती है।
यदि आप पहली बार उपयोगकर्ता हैं, तो आप प्लाज्मिड डीएनए व्यक्त करने वाले GFP की कोशिश कर सकते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन लिनयुआन एमए, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्टडॉक होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से मानव आईपीएससी प्राप्त करते हैं।
संस्कृति आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करने के बाद 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में फीडर-मुक्त सेल संस्कृति माध्यम के साथ कृत्रिम बाह्तीय मैट्रिक्स पर आईपीएससी। ट्रांसफेक्शन से दो घंटे पहले आईपीएससी को 10 माइक्रोमोलर रो-संबद्ध कुंडलित-कुंडल युक्त प्रोटीन किनेस अवरोधक वाई-27632 के साथ इलाज करें। ट्रांसफेक्टिंग करते समय, आईपीएससी को सेल टुकड़ी समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए अलग करें।
फिर कोशिकाओं की संख्या गिनें। खरगोश फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति स्थापित करने के लिए खरगोश कान की नोक से कान की त्वचा बायोप्सी प्राप्त करें। 5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीपीबीएस के साथ दो बार ऊतक कुल्ला।
कुल्ला कान के ऊतकों को एक नए छह सेंटीमीटर ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें और ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट लें, प्रत्येक के बारे में एक मिलीमीटर। ऊतक को सूखने से रोकने के लिए एफबीएस की कुछ बूंदें जोड़ें। इसके बाद, कटे हुए ऊतक को 10 सेंटीमीटर ऊतक संस्कृति पकवान में फैलाएं और 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
कोशिकाओं को तीन से पांच दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । चढ़ाना के बाद तीन से पांच दिन ट्रिप्पसिन-EDTA का उपयोग करने के लिए दो मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को पचाने, तो कोशिकाओं की संख्या गिनती । GRNAs और दाता ओलिगोस को डिजाइन और संश्लेषित करने के बाद, कोशिकाओं को पहले वर्णित के रूप में तैयार करें।
इलेक्ट्रोपॉनेशन बफर के 20 माइक्रोलीटर में 20 से 30, 000 कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। एक एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेट करें। Cas9 RNP ट्रांसफैक्शन के लिए, पूर्व मिश्रण Cas9 एनएलएस प्रोटीन के दो माइक्रोग्राम 10 से 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर GRNA के ०.६७ माइक्रोग्राम के साथ ।
धीरे-धीरे कोशिकाओं के साथ दो माइक्रोग्राम एसएसओडीएन के साथ गठित आरएनपी परिसर को मिलाएं। इलेक्ट्रोपाउनेशन किट से यूनिवर्सल पिपेट टिप्स का उपयोग करके, सेल मिश्रण को 20 माइक्रोलीटर इलेक्ट्रोपॉनेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रोपोराट के स्लॉट में इलेक्ट्रोपॉरेशन ट्यूब रखें और खत्म करने के लिए जाने के लिए प्रेस करें।
इलेक्ट्रोपोरेटर की डिस्प्ले स्क्रीन पर पल्स रिपोर्ट द्वारा एक सफल इलेक्ट्रोपोरेशन चक्र इंगित किया जाता है। इलेक्ट्रोपाउशन के बाद मानव आईपीएस कोशिकाओं को पूर्व-गर्म वाई-27632 के एक मिलीलीटर में स्थानांतरित कर दिया गया है जिसमें संस्कृति माध्यम शामिल है जैसा कि पहले वर्णित है। फिर 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक कुएं में पुनर्नसंस्म कोशिकाओं को प्लेट करें।
थाली की खेती जारी रखें, हर दिन संस्कृति माध्यम को बदलने के लिए सुनिश्चित कर रही है । वाई-27632 मानव आईपीएससी संस्कृति माध्यम से 24 घंटे इलेक्ट्रोपॉशन के बाद हटा दिया जाता है। इलेक्ट्रोपाउशन के 72 घंटे बाद कोशिकाओं की कटाई करें।
खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए, संस्कृति प्लेट से कोशिकाओं को पचाने के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करें। मानव आईपीएससी के लिए संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं को पचाने के लिए सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग करें। संक्षेप में पांच मिनट के लिए १००० आरपीएम पर नमूनों अपकेंद्रित्र, और लाइसिस बफर के ३५० मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च ।
रात भर 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। अगले दिन मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर फिनोल-क्लोरोफॉर्म के साथ जीनोमिक डीएनए निकालें। एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर या पीसीआर एसवी मिनी किट का उपयोग कर सीधे पीसीआर उत्पादों से सीधे का उपयोग कर जैल से डीएनए टुकड़े के १०० से २०० कुर्सियां जोड़े बढ़ाना ।
बैक्टीरियल कॉलोनी अनुक्रमण द्वारा जीन संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए, एक टीओओ-टीए क्लोनिंग किट का उपयोग करते हुए शुद्ध पीसीआर उत्पादों को पीसीआर4-टोपो वेक्टर में लिगेट करें। बेतरतीब ढंग से बैक्टीरियल क्लोन उठाओ और टोपो-टीए क्लोनिंग किट द्वारा प्रदान की गई सार्वभौमिक अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग करके आवेषण का अनुक्रम करें। गहरी अनुक्रमण द्वारा जीन संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए, डीएनए अनुक्रमण कोर में CRISPR एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के लिए पहले से प्राप्त शुद्ध पीसीआर उत्पादों को भेजें।
इस अध्ययन में एक ट्यूब इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि का प्रभावी ढंग से उपयोग किया जाता है CRISPR/Cas9 RNP और ssODNs खरगोश और मानव कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, मजबूत, सटीक जीन संपादन के लिए अग्रणी । सबसे पहले, C231Y और Q235X उत्परिवर्तन IL2RG जीन में उत्पादित कर रहे हैं, और R150G उत्परिवर्तन खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में एसपीआर जीन में उत्पादित किया जाता है । विशिष्ट sgRNA डिजाइन और जीन संपादन बैक्टीरियल टीए क्लोनिंग द्वारा निर्धारित दरों यहां दिखाया गया है ।
IL2RG C231 लोकस, अनुक्रमित 28 क्लोन में से, एक सटीक C231Y उत्परिवर्तन, चार ले प्रविष्टि या हटाने उत्परिवर्तन किया जाता है, और शेष 23 जंगली प्रकार के होते हैं । IL2RG Q235 लोकस में, अनुक्रमित 27 क्लोनों में से, दो सटीक Q235X उत्परिवर्तन ले, तीन एक indel उत्परिवर्तन ले, और शेष जंगली प्रकार के हैं । एसपीजी R150 लोकस में, 20 क्लोन अनुक्रम में से, पांच सटीक R150 जीन उत्परिवर्तन, 10 ले indel उत्परिवर्तन ले, और शेष जंगली प्रकार के हैं ।
ट्यूब इलेक्ट्रोपॉनेशन का उपयोग तब मानव आईपीएससी को Cas9 RNP और ssODNs वितरित करने और ईजीएफआर, माईबीपीसी 3 और एचबीबी जीन में चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक लोकी को लक्षित करने के लिए किया जाता है। ईजीएफआर लोकस में, 15.68% एलील्स सटीक बिंदु उत्परिवर्तन ले जाते हैं, 22.75% इनडेल म्यूटेशन लेते हैं, और शेष 61.57% जंगली प्रकार के होते हैं। Mybpc3 लोकस में, 37.92% सटीक चार आधार जोड़ी TGAA हटाने, 2.24% ले indel उत्परिवर्तन ले, और शेष 59.84% जंगली प्रकार हैं.
एचबीबी लोकस में, 11.5% सटीक E6V उत्परिवर्तन ले, 35.4% इनडेल म्यूटेशन ले, और शेष 65% जंगली प्रकार के हैं। Cas9 RNP प्लाज्मिड डीएनए की तुलना में अपने छोटे आकार के कारण Cas9 का पसंदीदा रूप है। ट्यूब इलेक्ट्रोपॉन्स्ट्रेशन Cas9 आरएनपी देने के लिए एक प्रभावी तरीका है।
हम विशेष रूप से कार टी अनुप्रयोगों के लिए प्राथमिक टी कोशिकाओं में Cas9 RNP के ट्यूब इलेक्ट्रोपाउशन का उपयोग करने में रुचि रखते हैं।
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