Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation
Chapters
Summary June 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presentert her er en protokoll for effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediert genredigering i pattedyrceller ved hjelp av tube electroporation.
Transcript
Sikker og effektivt å levere Cas9-elementer i celler er avgjørende for genredigeringsbaserte terapier. Protokollene vi viser her viser en ny tilnærming i den retningen. Protokollen benytter en ny elektroporasjonsmetode kalt rørelektroporasjon.
Dette fører til høye cellulære overlevelsesrater samt genredigeringsrater. Rørelektroporasjonsmetoden er virus, stoff og reporterberikelse gratis. Disse foretrekkes i kliniske applikasjoner, så med genredigeringsbaserte terapier.
Metoden gjelder universelt for mange celletyper. For eksempel kan menneskelige hematopoetiske celler, primære T-celler og andre celler alle redigeres ved hjelp av vår metode. Denne rørelektroporasjonsmetoden bruker et tynt rør.
Hvis du er en førstegangsbruker, kan du prøve GFP som uttrykker plasmid DNA. Å demonstrere prosedyren vil være Linyuan Ma, en postdoktor fra laboratoriet mitt. For å begynne denne prosedyren skaffe menneskelige iPSCer fra American Type Culture Collection.
Kultur iPSCene på kunstig ekstracellulær matrise med materfri cellekulturmedium i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid etter leverandørens instruksjoner. To timer før transfeksjon behandle iPSCs med 10 mikromolar Rho-assosiert kveilet-coil som inneholder protein kinase hemmere Y-27632. Ved transfisering, dissosiere iPSCer med celleavløsningsløsning til enkeltceller ved 37 grader Celsius i fem minutter.
Telle deretter antall celler. For å etablere en kanin fibroblast cellekultur få en øre hudbiopsi fra spissen av et kaninøre. Skyll vevet to ganger med DPBS som inneholder 5% penicillin-streptomycin.
Overfør det skyllede ørevevet til en ny seks centimeter vevskulturrett og kutt vevet i små biter, hver omtrent en etter en millimeter. Tilsett noen dråper FBS for å hindre at vevet tørker ut. Etter dette sprer du det strimlede vevet i en 10 centimeter vevskulturrett og legger til 10 milliliter kulturmedium.
Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre til fem dager. Tre til fem dager etter plating bruk Trypsin-EDTA å fordøye cellene på 37 grader Celsius i to minutter, og deretter telle antall celler. Etter å ha designet og syntetisert gRNAs og donor oligos, forberede cellene som tidligere beskrevet.
Resuspend 20 til 30, 000 celler i 20 mikroliter elektroporasjonbuffer. Pipette opp og ned nøye for å produsere en enkelt celle suspensjon. For Cas9 RNP transfection, pre-mix to mikrogram Cas9 NLS protein med 0,67 mikrogram gRNA ved romtemperatur i 10 til 15 minutter.
Bland forsiktig det dannede RNP-komplekset med to mikrogram ssODN med celler. Bruk universelle pipettespisser fra elektroporasjonssettet til å overføre celleblandingen til et 20 mikroliter elektroporasjonsrør. Plasser elektroporasjonsrøret i sporet på elektroporen og trykk gå til slutt.
En vellykket elektroporasjonssyklus indikeres av pulsrapporten på skjermen til elektroporatoren. Etter elektroporasjonen overfører de menneskelige iPS-cellene til en milliliter forhåndsoppvarmet Y-27632 som inneholder kulturmedium som tidligere beskrevet. Deretter plate de resuspended cellene i en brønn av en 12-brønns celle kultur plate.
Fortsett å dyrke platen, og sørg for å endre kulturmediet hver dag. Y-27632 fjernes fra det menneskelige iPSC-kulturmediet 24 timer etter elektroporering. 72 timer etter elektroporasjon høster cellene.
For en kanin fibroblast celler, bruk Trypsin-EDTA å fordøye cellene fra kulturplaten. For menneskelige iPSCer bruk celleavløsningsløsning for å fordøye cellene fra kulturplatene. Sentrifuger prøvene ved 1000 o/min i fem minutter, og gjenoppstår cellene med 350 milliliter lysisbuffer.
Inkuber over natten ved 55 grader Celsius. Neste dag trekker ut genomisk DNA med fenolklorform ved hjelp av standardprosedyrer. Forsterk 100 til 200 baser par DNA fragmenter fra geler ved hjelp av enten en gel ekstraksjon kit eller direkte fra PCR produkter ved hjelp av en PCR SV mini kit.
For å bestemme genredigeringseffektiviteten ved bakteriell kolonisekvensering, bruk et TOPO-TA kloningssett for å ligate de rensede PCR-produktene til en PCR4-TOPO-vektor. Tilfeldig plukke opp bakterielle kloner og sekvens innsatsene ved hjelp av en universell sekvensering primer levert av TOPO-TA kloning kit. For å fastslå genredigeringseffektiviteten ved dyp sekvensering, send de tidligere oppnådde rensede PCR-produktene for CRISPR ampliconsekvensering i en DNA-sekvenseringskjerne.
I denne studien brukes en rørelektroporasjonsmetode effektivt til å levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNer til kanin- og menneskeceller, noe som fører til robust, presis genredigering. For det første produseres C231Y- og Q235X-mutasjoner i IL2RG-genet, og R150G-mutasjonen produseres i SPR-genet i kaninfibroblastceller. De spesifikke sgRNA-designene og genredigeringsfrekvensene bestemmes av bakteriell TA-kloning, vises her.
IL2RG C231-locus, ut av de 28 klonene sekvensert, bærer en presis C231Y mutasjon, fire bære innsetting eller sletting mutasjoner, og de resterende 23 er vill-type. Ved IL2RG Q235-locus, ut av de 27 klonene som er sekvensert, bærer to den nøyaktige Q235X-mutasjonen, tre bærer en indel mutasjon, og de resterende er villtype. Ved SPG R150-locus, av de 20 klonene som er sekvensert, bærer fem den nøyaktige R150-genmutasjonen, 10 bærer indelmutasjoner, og de resterende er villtype.
Rørelektroporasjon brukes deretter til å levere Cas9 RNP og ssODNer til menneskelige iPSCer og målrette klinisk relevant loci i EGFR, Mybpc3 og HBB gener. Ved EGFR-locusen bærer 15,68% av allelene de nøyaktige punktmutasjonene, 22,75% bærer indelmutasjoner, og de resterende 61,57% er villtype. På Mybpc3 locus, 37,92% bære nøyaktig fire base pair TGAA sletting, 2,24% bære indel mutasjoner, og de resterende 59,84%er vill type.
Ved HBB-locusen bærer 11,5% den nøyaktige E6V-mutasjonen, 35,4% bærer indelmutasjoner, og de resterende 65% er villtype. Cas9 RNP er den foretrukne formen for Cas9 på grunn av sin mindre størrelse i forhold til plasmid DNA. Rørelektroporasjonen er en effektiv metode for å levere Cas9 RNP.
Vi er spesielt interessert i å utnytte rørelektroporering av Cas9 RNP i primære T-celler for CAR T-applikasjoner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
