Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)
Chapters
Summary August 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.
Transcript
İlaç afinite duyarlı hedef kararlılık, DARTS, yeni küçük moleküllü protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük moleküllü protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştiriyoruz.
Protein-ligand etkileşimleri iki eğri, bir proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi karşı çizilebilir. MTOR-rapamycin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. %10 fetal sığır serumu, iki milimolar glutamin ve %1 antibiyotik içeren DMEM kullanarak 293T hücreleri büyütün.
Kültürleri %5 karbondioksit insantininin 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültür %80-90'lık birleştiğinde hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri uygun miktarda soğuk hücre lisis tamponuna toplamak ve lysing hücrelerini 1,5 milimetrelik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Lysis tamponve lysing hücreleri iyice karıştırmak ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka ters. Tüpü 18,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzüzerinde soğutulun.
Lysatların protein konsantrasyonu yaklaşık bca test gerçekleştirmek ve protein konsantrasyonu dayalı pronase seyreltme hesaplamak. İlk olarak, iki 1.5 mililitrelik tüpler, 99 mikrolitre her içine lysate aktarın. Lysate her aliquot için küçük moleküllü stok çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve sallayarak oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca iki tüp kuluçka.
Buz üzerinde, 1x TNC taze çözülmüş pronase çözeltisi seri seyreltme kurmak. Küçük molekül ile kuluçka sonra, beş tüpler halinde örneklerin 20 mikrolitre içine her aliquot bölün. Aynı sindirim süresini sağlamak için, her 30 saniyede bir belirli aralıklarla, numunelere hazırlanan pronase çözeltilerinin iki mikrolitresini ekleyin.
Bir kontrol grubu için, Iki mikrolitre TNC arabelleği ekleyin. Beş ila 20 dakika sonra, 30 saniyelik aralıklarla soğuk 20x proteaz inhibitör kokteyl iki mikrolitre ilave yoluyla altı tüplerin sindirim durdurmak. İyibir şekilde karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Her numuneyi altı mikrolitre 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile seyreltin ve numuneleri 70 derecede 10 dakika kaynatın. Şimdi, Batı leke gerçekleştirmek için, uygun bir moleküler ağırlık belirteci ile birlikte, bir % 8 SDS-PAGE jel kuyularına protein eşit miktarda yükleyin. 80 volt 30 dakika jel çalıştırın, sonra 120 volt volta voltaj ı ayarlayın ve bir ila iki saat boyunca çalışmaya devam edin.
Küçük molekülün potansiyel hedef proteinlere doğrudan bağlanabilen ivedu. Bu protokolde, küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma doğruladı. Üç bant araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunduğu tespit edilebildi.
Batı lekeleme, düşük pronase ile protein oranlarında mTOR proteininin varlığını ve artan oranlarda azalma ve kaybını göstermiştir. Pronase tarafından mTOR proteolisisi açıkça rapamisin varlığı ile inhibe edildi ve rapamisin eklenmesi proteolitik eğribelirgin bir kayma üretti. Rapamisin doz-bağımlı mTOR düzeyini artırdı, rapamisin tedavisi ile mTOR artan istikrar düşündüren.
Hedef protein bandı yoğunluklarının ölçülmesi mTOR'un rapamisinin hedef proteini olduğunu göstermiştir. En iyi stepwise etkisi elde etmek için, bu deney protein oranları üzerinde pronase uygun bir dizi elde etmek için birkaç kez tekraredilmesi gerekebilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
