Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion
Chapters
Summary August 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I denne undersøgelse forbedrede vi dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Samspillet kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som et eksemplarisk tilfælde.
Transcript
Drug affinitet lydhør mål stabilitet, DARTS, er en robust metode til påvisning af nye små-molekyle protein mål. Det kan bruges til at kontrollere kendte små-molekyle protein interaktioner og til at finde potentielle protein mål for naturlige produkter. I denne undersøgelse forbedrer vi yderligere darts-eksperimentets dataanalysekapacitet ved at overvåge ændringerne i proteinstabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligandinteraktioner.
Protein-ligand interaktioner kan plottes mod to kurver, en proteolytisk kurve og en dosis-afhængighed kurve. Vi har brugt mTOR-rapamycin interaktion som en eksemplarisk sag for oprettelsen af vores protokol. Vokse 293T celler ved hjælp af DMEM med 10% føtal kvæg serum, to-millimolar glutamin, og 1% antibiotika.
Inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Når kulturen når 80 til 90%sammenløb, vaskes cellerne to gange med kold PBS. Brug en celleskraber til at samle cellerne i en passende mængde koldcellelysisbuffer og overfør lyscellerne til et 1,5 millimeter rør.
Invertere til at blande lysis buffer og lysing celler godt og inkubere røret på is i 10 minutter. Centrifuge røret ved 18, 000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliterrør og hold den kølet på is.
BCA-analysen udføres for at tilnærme proteinkoncentrationen af lysater og beregne fortyndingen af pronase baseret på proteinkoncentrationen. Først overføres lysatet til to 1,5 milliliterrør, 99 mikroliter hver. Tilsæt en mikroliter af små molekyle lageropløsning til hver aliquot af lysate og inkubere de to rør i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur med omrystning.
På is, etablere serielle fortyndinger af frisk optøet pronase opløsning i 1x TNC. Efter inkubationen med det lille molekyle opdeles hver aliquot i 20 mikroliter af prøver i fem rør. For at sikre den samme fordøjelsestid med bestemte intervaller på hver 30.
For den ene kontrolgruppe skal du tilføje to mikroliter TNC-buffer. Efter fem til 20 minutter standse fordøjelsen af de seks rør ved tilsætning af to mikroliter af kold 20x proteasehæmmer cocktail med 30-sekunders intervaller. Bland godt og inkubere på is i 10 minutter.
Hver prøve fortyndes med seks mikroliter 5x SDS-PAGE-læssebufferen, og prøverne koges i et vandbad ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Nu, at udføre Western blot, belastning lige store mængder af protein i brøndene af en 8% SDS-PAGE gel, sammen med en passende molekylvægt markør. Kør gelen i 30 minutter ved 80 volt, juster derefter spændingen til 120 volt og fortsæt med at køre i en til to timer.
Kontroller, at det lille molekyle kan binde direkte til de potentielle målproteiner. I denne protokol bekræftede inkubation med det lille molekyle beskyttelsen mod proteolyse. Tre bånd blev fundet at være beskyttet ved inkubation med rapamycin over køretøjets kontrol.
Western blotting illustrerede tilstedeværelsen af mTOR-protein ved lave pronase-til-proteinforhold og dets reduktion og tab med stigende nøgletal. Proteolyse af mTOR ved pronase var tydeligt hæmmet af tilstedeværelsen af rapamycin, og tilsætning af rapamycin skabte et tydeligt skift i den proteolytiske kurve. Rapamycin-dosis-afhængig forbedret niveauet af mTOR, hvilket tyder på den stigende stabilitet af mTOR med rapamycin behandling.
Kvantificering af målproteinbåndintensiteten tydede på, at mTOR er målproteinet for rapamycin. For at få den bedste trinvise effekt, dette eksperiment kan være nødvendigt at gentage flere gange for at opnå et passende udvalg af pronase over protein nøgletal.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
