Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En semi-kvantitativ Läkemedelstillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart) test för att studera rapamycin/mTOR interaktion
Chapters
Summary August 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I denna studie, vi förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Interaktionerna kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dosberoende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall.
Transcript
Läkemedelsaffinitetsresponsiv målstabilitet, DARTS, är en robust metod för detektion av nya småmolekylproteinmål. Det kan användas för att verifiera kända småmolekylprotein interaktioner och för att hitta potentiella protein mål för naturliga produkter. I denna studie förbättrar vi ytterligare dataanalyskapaciteten hos DARTS-experimentet genom att övervaka förändringar i proteinstabilitet och uppskatta tillhörigheten hos protein-ligand interaktioner.
De protein-ligand interaktioner kan ritas mot två kurvor, en proteolytisk kurva och en dos-beroende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett föredömligt fall för inrättandet av vårt protokoll. Odla 293T celler med DMEM med 10%fetala nötkreatur serum, två-millimolar glutamin, och 1%antibiotika.
Inkubera kulturerna i 37 grader Celsius under 5%-koldioxid. När kulturen når 80 till 90%sammanflödet, tvätta cellerna två gånger med kalla PBS. Använd en cellskrapa för att samla in cellerna till en lämplig mängd kallcells-lysbuffert och för över de lysande cellerna till ett 1,5-millimeters rör.
Invertera för att blanda lysbufferten och lysningscellerna väl och inkubera röret på is i 10 minuter. Centrifugera röret vid 18, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Överför supernatanten till ett nytt 1,5-milliliterrör och kyls på is.
Utför BCA-analys för att approximera proteinkoncentrationen av lysater och beräkna pronasens utspädning baserat på proteinkoncentrationen. För det första, överför lysate i två 1,5-milliliter rör, 99 mikroliter vardera. Tillsätt en mikroliter av liten molekyl stamlösning till varje alikvot av lysate och inkubera de två rören i 30 till 60 minuter vid rumstemperatur med skakningar.
På is, upprätta serieutspädningar av nytinad pronaselösning i 1x TNC. Efter inkubationen med den lilla molekylen, dela varje alikvot i 20 mikroliter av prover i fem rör. För att säkerställa samma matsmältningstid, med specifika intervaller på var 30 sekunder, tillsätt två mikroliter av de beredda pronase lösningarna till proverna därefter.
För en kontrollgrupp, lägg till två mikroliter av TNC-buffert. Efter fem till 20 minuter, stoppa matsmältningen av de sex rören via tillägg av två mikroliter av kall 20x proteashämmare cocktail med 30-sekunders intervall. Blanda väl och inkubera på is i 10 minuter.
Späd varje prov med sex mikroliter av 5x SDS-PAGE lastningsbuffert och koka proverna i ett vattenbad vid 70 grader Celsius i 10 minuter. Nu, för att utföra western blot, ladda lika stora mängder protein i brunnarna i en 8% SDS-PAGE gel, tillsammans med en lämplig molekylvikt markör. Kör gelen i 30 minuter vid 80 volt, justera sedan spänningen till 120 volt och fortsätt köra i en till två timmar.
Verifiera att den lilla molekylen kan binda direkt till de potentiella målproteinerna. I detta protokoll bekräftade inkubation med den lilla molekylen skyddet mot proteolys. Tre band befanns skyddas genom inkubation med rapamycin över fordonets kontroll.
Västra blotting illustrerade förekomsten av mTOR protein vid låga pronase till protein nyckeltal och dess minskning och förlust med ökande nyckeltal. Proteolys av mTOR av pronase var klart hämmas av förekomsten av rapamycin och tillägg av rapamycin genereras en uppenbar förskjutning i proteolytic kurvan. Rapamycin dos-ökat beroende nivån av mTOR, vilket tyder på den stigande stabiliteten hos mTOR med rapamycin behandling.
Kvantifiering av målet protein band intensiteter föreslog att mTOR är målet protein av rapamycin. För att få den bästa stegvis effekt, detta experiment kan behöva upprepas flera gånger för att få ett lämpligt utbud av pronase över protein nyckeltal.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
