Vi rapporterar Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metod som möjliggör snabb och effektiv uttryck för flera proteiner i vaktel embryo modellsystem. Denna metod kan användas för att fluorescerande etikettceller och registrera deras in vivo rörelser av Time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.
Vi rapporterar att mRNA elektroporation tillåter fluorescerande proteiner för att märka celler i levande vaktel embryon snabbare och bredare än DNA-elektroporation. Den höga transfektionseffektiviteten tillåter minst 4 distinkta mRNAs att co-transfected med ~ 87% effektivitet. De flesta av de elektroporerade mRNAs bryts ned under de första 2 h post-elektroporation, tillåter tidskänsliga experiment som skall utföras i det växande embryot. Slutligen beskriver vi hur man dynamiskt bild levande embryon electroporated med mRNAs som kodar olika subcellulära riktade fluorescerande proteiner.
Electroporation är en fysisk transfection metod som använder en elektrisk puls för att skapa övergående porer i plasmamembranet, vilket gör att ämnen som nukleinsyror eller kemikalier att passera in i cytosolen. Elektroporation används ofta för att leverera DNA till bakterier, jäst, växter, och däggdjursceller1,2,3. Det används rutinmässigt för att införa genetiska nyttolaster i målceller och vävnader inom det framtagande aviär embryot för att studera genetisk kontroll av utveckling eller etikett som migrerar populationer av celler4,5,6, 7. Emellertid, flera experimentella begränsningar finns också med DNA-elektroporation8. Till exempel introducerar DNA-elektroporation ofta mycket varierande antal uttrycks vektorer per cell och därefter de mRNAs och proteiner de kodar. Denna variation kan leda till betydande cellcellers heterogenitet som kompliserar både bildanalys och data tolkning9,10. Dessutom, proteiner från DNA-elektroporation börjar bara att uttrycka ~ 3 h post-elektroporation och inte når den maximala effektiviteten i cell nummer och fluorescens intensitet tills 12 h, sannolikt på grund av den tid som krävs för att överföra till kärnan och komplett både transkription och översättning in vivo11.
Däremot har mRNA transfektion använts effektivt i en mängd olika modellsystem, inklusive Xenopus laevis oocyter av görs12,13, omprogrammering mänskliga stamceller av mRNA lipofectamine transfection14 , och electroporating motsträvt neurala stamceller hos vuxna möss15. Vi testade förmågan hos mRNA elektroporation att effektivt märka celler under tidig aviär embryonal utveckling med in vitro syntetiserade mrnas som kodar distinkta fluorescerande proteiner (FPS). För våra studier använde vi pCS2 + Vector, en mångsidig uttrycks vektor som ofta används för att uttrycka proteiner i embryon från Xenopus och zebrafiskar. De SP6-och T7 RNA-polymerasinitiativtagarna i pCS2 + tillåter syntesen av mRNA och protein från någon klonad gen när den används i en in vitro-transkription/översättningssystem.
Här visar vi att mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPS) i gastrulating vaktel embryon. Vi utformade och genererade många av de uttryck vektorer som används i dessa studier. Till exempel subklonade vi LifeAct-eGFP Gene16 i pCS2 + Vector17 för att uttrycka från CMV promotorn och SP6 promotorn. Den insatta genen ligger nedströms av den SP6 promotorn och upstream av SV40 poly (A) Svanen18. I embryon Co-electroporated med mRNA och DNA, FPs kodade från in vitro transkriberas mRNAs upptäcktes först inom 20 min av Electroporation, medan FPs från DNA-uttryck vektorer upptäcktes först efter 3 h. flera mRNAs-kodning för Nuclear, Golgi och membranproteiner kan elektroporeras till ett embryo samtidigt, vilket resulterar i ett snabbt och effektivt uttryck av flera proteiner i enskilda celler. Slutligen, med hjälp av en in vivo fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) assay, visar vi att en majoritet av den elektroporerade mRNAs förfall inom 2 h. Således, snabb initial proteinproduktion kombinerat med begränsad ny protein översättning gör mRNA elektroporation en värdefull teknik när temporala kontroll av uttrycket är nödvändigt.
I detta protokoll, vi gav steg för steg instruktioner om hur man exakt microinjicera och elektroporate mRNA i cellerna i gastrulating vaktel embryon. Vi visade att in vitro syntetiserade mRNA elektroporation möjliggör snabb och effektiv uttryck för fluorescerande proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryon (figur 2 och 3). Fluorescens från H2B-Citrin protein översatt från electroporated mRNAs kunde upptäckas av konfokalmikroskopi inom ~ 20 min och ökade i FP-fluor…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar David Huss för hjälpsamma insikter i detta arbete. Detta arbete stöddes delvis av Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) och USC Provost ‘ s undergrad Research Fellowship to MT, den Saban Research Institute intramural utbildning pre-doc Award till MD, och University of Southern California Grundutbildning Research Associates program Award till R.L.
BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
1.37 M NaCl | |||
27 mM KCl | |||
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
0.1% Triton X-100 |