Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Единый сдвига Ассси для человека тромбоцитов и клеточных поверхностных рецепторов через конус-пластины Viscometry
Chapters
Summary June 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы описываем в растворе метод нанесения равномерного сдвига на рецепторы поверхности тромбоцитов с помощью конусно-пластинной вискомерности. Этот метод также может быть использован более широко для нанесения сдвига на другие типы клеток и клеточных фрагментов и не нужно нацеливаться на конкретную пару лиганд-рецепторов.
Transcript
Этот протокол позволяет нам ответить на различные вопросы о том, как стрижка действует на клетки в растворе и обеспечивает значительный контроль над длительностью и величиной стрижки. В отличие от других методов, которые обнаруживают влияние стрижки на клетки, которые обездвижены, этот метод позволяет нам применять снооблочные клетки в растворе и поддается спектру методов обнаружения сигналов ниже по течению. После получения периферической крови от согласия, здоровый взрослый донор в 4,5-миллилитровой трубке 3,8%trisodium цитрат, центрифуга крови, чтобы получить богатые тромбоцитами плазмы, и использовать пипетку кончик вырезать под углом 45 градусов, чтобы тщательно удалить в результате чего верхней, облачной, желтой тромбоцитов богатых плазменный слой.
Получить количество тромбоцитов через полный анализ крови, и настроить количество тромбоцитов примерно в 2,5 раза от 10 до пятого тромбоцитов на микролитер с бассейном человека тромбоцитов бедных плазмы. Затем поместите подвеску на 22 градуса цельсия с нежным вращением. Для лечения лиганда, медленно добавить антитела или лиганд интереса к тромбоцитов богатых плазмы, и смешать тромбоциты мягко.
Во время инкубации включите конусообразный вискометр и установите температуру пластины до 22 градусов по Цельсию. Через 5-10 минут перенесите обработанную плазму, богатую тромбоцитами, на контролируемый температурой конусообразный вискометр непосредственно в центре пластины, заботясь о том, чтобы весь образец был отложен между конусом и пластиной в точке соприкосновения. Чтобы применить сноф к образцу, вычислите сноф в соответствии с руководством по вискометровому анализу и примените ее к образцу с соответствующей скоростью и продолжительностью.
В конце применения, поднимите конус около двух миллиметров от пластины, так что образец остается в контакте с пластиной и конусом, и использовать гель-загрузки пипетки отзыв для сбора от пяти до 10 микролитров из центра объема образца. Затем инкубировать прорубь образца с антителами против поверхностных маркеров интерес в течение 20 минут при комнатной температуре, и исправить образцы в 2%paraformaldehyde в течение 20 минут при комнатной температуре. Чтобы проанализировать образцы по цитометрии потока, соберите не менее 20 000 событий для каждого состояния и количественно оцените силу сигнала каждого флуоресцентного маркера, используя значение высоты для интенсивности каждого флюорофора.
Затем используйте отрицательный контроль с бычьим альбумин сыворотки или транспортного средства, чтобы нарисовать ворота, исключая негативный фон флуоресцентных событий, и количественно процент событий внутри ворот для всех экспериментальных условиях. Выражение маркера активации тромбоцитов в ответ на применение силы стрижки не регулируется в зависимости от времени образом. Здесь показаны репрезентативные считывания активации тромбоцитов человека в присутствии двух антител, нацеленных на N-терминальный домен гликопротеина 1b-IX и одно контрольное антитело при стрижке и статических условиях.
Выражение всех трех маркеров активации было значительно увеличено в присутствии сил стрижки и ориентации антител, по сравнению с либо статических условий или в присутствии антител контроля. Примечательно, что лечение антителами с необязаемой силой слишком низко, чтобы вызвать активацию гликопротеина 1b-IX, не вызывает активации тромбоцитов в условиях статической или стрижки. Кроме того, плазма от пациентов иммунной тромбоцитопении, содержащих антитела против гликопротеина 1b-IX вызвать стрижку зависимых реакций в отличие от плазмы от пациентов без гликопротеина 1b-IX ориентации антител.
В дополнение к flowcytometric анализов, клетки, которые подверглись воздействию снопы могут быть также lysed для западной помарки, ELISA, и масс-специальный анализ для определения любых изменений в уровне белка. Как всегда, при использовании крови или человеческих образцов, не забудьте носить надлежащее защитное оборудование и следовать безопасности лаборатории и крови родился патоген руководящих принципов вашего учреждения.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
