Biology
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Ein Uniform Shear Assay für menschliche Platelets und Zelloberflächen per Cone-plate Viscometry
Chapters
Summary June 5th, 2019
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Wir beschreiben eine In-Solation-Methode, mit der mittels der Vonenplattenviskometrie einheitliche Schere auf Plattenoberflächen aufgetragen werden kann. Diese Methode kann auch breiter verwendet werden, um Schere auf andere Zelltypen und Zellfragmente aufzutragen und muss nicht auf ein bestimmtes Liga-Rezeptor-Paar zielen.
Transcript
Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine Vielzahl von Fragen über die Art und Weise zu beantworten, wie scheren auf Zellen in Lösung und bietet signifikante Kontrolle über Scherdauer und Größe. Im Gegensatz zu anderen Techniken, die die Wirkung der Scherung auf immobilisierte Zellen erkennen, ermöglicht uns diese Technik, die Scherung auf Zellen in Lösung anzuwenden und eignet sich für ein Spektrum nachgeschalteter Signaldetektionsmethoden. Nach Erhalt peripheren Blutes von einem zustimmenden, gesunden erwachsenen Spender in einem 4,5-Milliliter-Röhrchen mit 3,8% Trinatriumcitrat zentrifugieren, zentrifugieren Sie das Blut, um blutestreiches Plasma zu erhalten, und verwenden Sie eine Pipettespitze, die in einem 45-Grad-Winkel geschnitten wird, um die resultierende obere, trübe, gelbe Thrombozyten-reiche Plasmaschicht sorgfältig zu entfernen.
Erhalten Sie die Thrombozytenzahl über das vollständige Blutbild, und stellen Sie die Thrombozytenzahl auf etwa 2,5 mal 10 bis zu den fünften Blutplättchen pro Mikroliter mit gepooltem menschlichen Thrombozyten-armen Plasma ein. Dann stellen Sie die Federung bei 22 Grad Celsius mit sanfter Rotation. Für die Ligandenbehandlung den Antikörper oder Liganden, der von Interesse ist, langsam in das plättchenreiche Plasma geben und die Thrombozyten sanft mischen.
Schalten Sie während der Inkubation das Kegelplattenviskosemeter ein und stellen Sie die Plattentemperatur auf 22 Grad Celsius ein. Übertragen Sie das behandelte Plättchen-reiche Plasma nach fünf bis zehn Minuten direkt in der Mitte der Platte auf das temperaturgeregelte Kegelplattenviskometer, wobei darauf zu achten ist, dass sich die gesamte Probe zwischen Kegel und Platte an der Kontaktstelle ablagert. Um die Schere auf die Probe anzuwenden, berechnen Sie die Schere gemäß dem Viskometerhandbuch, und wenden Sie die Schere mit der entsprechenden Rate und Dauer auf die Probe an.
Heben Sie am Ende der Anwendung den Kegel etwa zwei Millimeter von der Platte ab, so dass die Probe sowohl mit der Platte als auch mit dem Kegel in Kontakt bleibt, und verwenden Sie eine Gel-Ladepipettenspitze, um fünf bis zehn Mikroliter aus der Mitte des Probenvolumens zu sammeln. Dann inkubieren Sie die gescherte Probe mit Antikörpern gegen die Oberflächenmarker von Interesse für 20 Minuten bei Raumtemperatur, und fixieren Sie die Proben in 2%Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Proben durch Durchflusszytometrie zu analysieren, sammeln Sie mindestens 20.000 Ereignisse für jede Bedingung und quantifizieren die Signalstärke jedes Fluoreszenzmarkers unter Verwendung des Höhenwerts für die Intensität jedes Fluorophors.
Verwenden Sie dann eine negative Kontrolle mit Rinderserumalbumin oder Fahrzeug, um ein Tor zu zeichnen, ohne negative Hintergrundfluoreszenzereignisse, und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Ereignisse innerhalb des Gates für alle experimentellen Bedingungen. Der Thrombozytenaktivierungsmarkerausdruck als Reaktion auf die Scherkraftanwendung ist zeitabhängig unreguliert. Hier werden repräsentative Auslesungen der menschlichen Thrombozytenaktivierung in Gegenwart von zwei Antikörpern gezeigt, die auf die N-Terminal-Domäne von Glykoprotein 1b-IX und einen Kontrollantikörper unter gescherten und statischen Bedingungen abzielen.
Die Expression aller drei Aktivierungsmarker wurde in Gegenwart von Scherkräften und Zielantikörpern signifikant erhöht, verglichen mit statischen Bedingungen oder in Gegenwart von Kontrollantikörpern. Insbesondere löst die Behandlung mit Antikörpern mit einer zu geringen Bindungskraft, um die Aktivierung von Glykoprotein 1b-IX auszulösen, keine Thrombozytenaktivierungsmarker-Upregulation unter statischen oder Scherkraftbedingungen aus. Darüber hinaus lösen Plasmavon Immunthrombozytopenie-Patienten, die Antikörper gegen Glykoprotein 1b-IX enthalten, scherabhängige Reaktionen aus, im Gegensatz zu Plasma von Patienten ohne Glykoprotein 1b-IX, die auf Antikörper abzielen.
Zusätzlich zu den flowzytometrischen Analysen können Zellen, die der Scherung ausgesetzt wurden, auch für Western Blot-, ELISA- und Massenspezifikationsanalysen lysiert werden, um Veränderungen des Proteinspiegels zu bestimmen. Wie immer, bei der Verwendung von Blut oder menschlichen Proben, achten Sie darauf, die richtige Schutzausrüstung zu tragen und folgen Sie den Laborsicherheits- und blutgeborenen Krankheitserregerrichtlinien Ihrer Institution.
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