Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning av ekstravaskulær Trypanosoma parasitter av fine Needle aspirasjon
Chapters
Summary August 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fin nål aspirasjon er en teknikk, der cellene er Hentet fra en lesjon eller organ ved hjelp av en tynn nål. Pustende materialet er smurt, beiset og undersøkt under et mikroskop for diagnose eller brukes til molekylærbiologi, flowcytometri eller in vitro analyse. Det er billig, enkel, rask og forårsaker minimale traumer.
Transcript
Fin nål aspirasjon cytologi er en billig, enkel, rask og minimal invasiv teknikk som vi bruker til å samle trypanosomer fra håndgripelige lesjoner i organer i levende mus. Gitt at fin nål aspirasjon er en ikke-terminal prosedyre, gjør det mulig for gjentatt prøvetaking i samme dyr over tid. Hvis disse funnene kan oversettes til storfe, vil denne metoden være svært nyttig for veterinærer å diagnostisere trypanosomiasis hos storfe i en gård.
Å demonstrere smørefargingsprosedyren vil være Ana Margarida Santos, en assisterende teknolog fra laboratoriet mitt. For å begynne, bekreft bedøvelse med tåklemingsmetoden. Når refleksen av tilbaketrekking av beinet er fraværende, plasser musen i dorsal recumbency.
Palper testiklene nøye for å bestemme størrelsen og avstanden fra den overlying huden og deretter begrense den mellom indeksen og langfingeren eller mellom pekefingeren og tommelen. For ytterligere å immobilisere målet, strekk den overlying huden tett og rengjør overflaten med alkoholservietter. Deretter setter du nålespissen på en 23 gauge kanyle koblet til en fem milliliter sprøyte inn i målet, og pass på at stempelet er i hviletilstand.
For å påføre suge, trekk sprøytestempelet tilbake til tre til fire millimetermerket to til tre ganger. For å øke sannsynligheten for å få en representativ prøve og for å målrette mindre strukturer som epididymis, omdirigere nålen i orgelet enten i en rett linje eller langs flere forskjellige tangekter. Slipp sugesuging og trekk deretter kanylen tilbake.
Nålen kan bare fjernes etter at det negative trykket er frigjort ved å gi slipp på stempelet. Ellers blir aspiraten sugd inn i sprøyten og kan ikke gjenopprettes. Påfør trykk med en steril gasbind svamp på punkteringsstedet for å kontrollere blødninger.
Koble sprøyten fra kanylen og fyll den med luft. Koble nålen igjen, plasser spissen av nålen svært nær eller til og med på lysbildet og løs forsiktig innholdet på nålen på lysbildet. For å sikre replikere prøvetaking, utfør minst en ekstra aspirasjonsperspirasjonspergel og dyr.
Etter å ha gått tilbake anestesi med en subkutan injeksjon av 200 mikroliter på ett mg per kilo Atipamezol i saltvann, returnere dyr til deres hjem bur for utvinning. Bruk den ikke-dominerende hånden til å plukke opp lysbildet som har dråpe aspirate som klemmer den frostede enden mellom tommelen og pekefingeren. Bruk den dominerende hånden til å plukke opp et rent spredningslysbilde og plasser den glatt ren kant over det andre lysbildet like på toppen av dråpen i en vinkel på ca. 30 grader.
For å få en tynn film, gli lysbildet fremover med ett lys kontinuerlig og jevn bevegelse. Hvil lysbildet og la det være mulig å tørke hele og raske luften av materialet. Merk den frostede kanten av lysbildet med en blyant.
For Giemsa-fargeprotokollen må du fikse lufttørkede flekker ved å senke lysbildene ned i en Coplin-krukke som inneholder 100 % metanol i fem minutter. Overfør deretter lysbildene til en Coplin-krukke som inneholder 20 % Giemsa-løsning og destillert vann i 30 minutter. Skyll lysbildene i vann fra springen og dab med silkepapir for å tørke grundig.
Mens du holder lysbildet horisontalt, påfør flere dråper ikke-vandig monteringsmedium på smøringen. Plasser kanten av et dekkglass på lysbildet, senk den og trykk forsiktig for å fjerne eventuelle luftbobler. For immunocytochemistry, fikse lufttørkede flekker i 100% metanol ved romtemperatur i 10 minutter.
Vask lysbildet i fem minutter i en Coplin-krukke med 1X PBS som gjentar dette trinnet tre ganger ved hjelp av fersk 1X PBS hver gang. Etter å ha fjernet lysbildene fra Coplin-krukken, tørk av overflødig buffer uten å berøre smøringen og tegn en linje rundt smøret med en vannavvisende penn. Mens du holder lysbildet horisontalt, påfør 150 mikroliter fortynnet primær antistoffløsning på hvert smør og inkuber i en time ved romtemperatur.
Etter inkubasjon vasker du lysbildene i fem minutter i en Coplin-krukke med 1X PBS som gjentar dette trinnet tre ganger ved hjelp av fersk 1X PBS hver gang. Mens du holder lysbildet horisontalt, påfør 150 mikroliter av kommersielt tilgjengelige heste reddik peroxidase DAB visualiseringssystem til hvert smøre og deretter inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildene igjen tre ganger i fem minutter i PBS.
Deretter motvirke ved å fordype lysbildene i en Coplin krukke som inneholder Harris hematoksylin i 10 sekunder. Skyll av i vann fra springen og dab med papir for å tørke grundig. Mens du holder lysbildet horisontalt, påfør flere dråper ikke-vandig monteringsmedium på smøringen.
Plasser kanten av et dekkglass på lysbildet, senk den og trykk forsiktig for å fjerne eventuelle luftbobler. En god kvalitet smøre var preget av en monolayer av celler med god tetthet og bevartmorfologiske funksjoner som tillater identifisering av deres vev av opprinnelse og relativ andel mellom hverandre. Videre var parasitter effektivt immunostained, identifiserbare og countable.
Dårlig eller negativ fin nål aspirasjon resultater kan skyldes for lite materiale og dermed under representant for massen eller orgelet. Det kan også skyldes for mye materiale på et enkelt lysbilde som gjør altfor tykke flekker og svekker cytologisk evaluering. Såkalt knust artefakt skjer på grunn av for mye kraft blir brukt når du gjør smøring forlater til forstyrret celler resulterer i mange nakne kjerner og DNA striper.
Når ikke nok kraft påføres under smørepreparatet, disaggregate cellene ikke resulterer i et stratifisert lag som innebærer evaluering av de morfologiske egenskapene til cellene. Sammenligning av fin nål aspirasjon cytopatologi med histopatologi, cytopatologi hadde fordelen av bedre bevart cellulær morfologi og bedre vurdering av relative proporsjoner og telling av celler. Immunocytochemistry er enklere, raskere og lettere å optimalisere enn immunohistochemistry.
For fin nål aspirasjon, sørg alltid for en god immobilisering av dyret, stabilisering av organer eller masse som skal aspireres, og en koordinert vakuumapplikasjon og frigjøring. Deretter for høy kvalitet flekker, umiddelbart spredt etter at materialet er plassert på glasset og være forsiktig på styrken som brukes for å gjøre smør for å unngå celle knust artefakter. I tillegg til rutinemessig mikroskopi og immunocytokjemi, kan dette materialet også brukes til elektronmikroskopi, biokjemisk analyse, strømningscytometri, molekylærbiologi, eller til og med for in vitro-analyser.
Denne teknikken tillot oss å demonstrere at fin nål aspirasjon kan brukes til å diagnostisere og studere sykdom hos eksperimentelle dyr. Vi var i stand til å diagnostisere tropisme av Trypanosoma parasitter til de ytre mannlige reproduktive organer og også å karakterisere denne sykdommen i løpet av infeksjonen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
