Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantitative tilgange til at studere cellulære strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans
Chapters
Summary July 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne undersøgelse skitserer kvantitative målinger af synaptisk størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans ved hjælp af frit tilgængelige billedbehandling værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt for fremtidige studier i C. elegans at sammenligne omfanget af vævs-og organelle strukturændringer som følge af genetiske mutationer.
Transcript
Evnen til at kvantificere ændringer i morfologien af væv og organeller er vigtig for at forstå genfunktion samt virkningen af genetiske mutationer. Vores protokoller forklarer, hvordan frit tilgængelig software kan bruges til ikke-subjektivt vurdering af morfologi synapser, muskler og mitokondrier i en nematode, C.elegans. Mange tidligere undersøgelser har været baseret på kvalitative metoder til sammenligning af morfologiske ændringer.
Men, disse kan være problematisk, da de ikke kan fange subtile fænokomypiske forskelle, kan over og undervurdere ændringer, og vurderes subjektivt. Vores kvantitative metoder giver mere robuste og mindre forudindtagede midler til vurdering af morfologiske ændringer. Disse metoder kan let anvendes til at studere morfologiske ændringer i andre cellulære strukturer eller modelorganismer med henblik på at definere genfunktionen og konsekvenserne af sygdomsrelaterede mutationer.
Start med at forberede slides til billedbehandling. Placer en dråbe en smeltet agarose på et mikroskop dias og straks trykke ned dråben med en anden mikroskop dias, forsigtigt udfladning af agarose. Lad agarose tørre i et minut derefter forsigtigt adskille de to dias og lad størknede pad på en af dias.
Placer dias på mikroskop scenen og tilsæt en fem til 10-milliliter dråbe bedøvelsesmiddel til midten af agarose pad. Brug en varmesteriliseret pick til hurtigt at overføre 10 til 15 dyr fra lagerpladen til bedøvelsesdråbe, før opløsningen tørrer ud. Derefter anvende en coverslip ved at placere det lige over agarose pad og forsigtigt slippe det ned.
Billede synaptiske regioner med en linje-scanning konfokal mikroskop koblet til en 488 og 552 nanometer optisk pumpet halvleder diode laser og udstyret med billedoptagelse software. Når du har lokaliseret ormene, skal du skifte til en 40X-forstørrelse og anvende nedsænkningsmediet. Visuel synaptic regionen ved spændende fluorophores med en 552 nanometer laser, 1% magt til tagRFP fluorophore, og 488 nanometer, 2% magt til GFP fluorophore.
Tag billeder ved hjælp af en hybrid fotodetektor og sæt gevinster for at forhindre overeksponering af fluorophores. Saml Z-stack billeder til at dække hele synapsen ved hjælp af den optimale Z-trin størrelse afhængigt af målet. Hvis du vil analysere det synaptiske område, skal du begynde med at indlæse billederne i CellProfiler 3.1.5-softwaren.
Konfigurer modulet NameAndType, og bestem den synaptiske område for hånd-definition ved hjælp af det diffuse tagRFP, der er udtrykt fra UIS-115-transgenet. Mål størrelsen og fluorescensen af den hånddefinerede synapse ved at tilføje modulerne MeasureObjectSizeShape og MeasureObjectIntensity til rørledningen. Den relative integrerede fluorescensintensitet beregnes derefter ved at tilføje CalculateMath-modulet og dividere de integrerede intensitetsenheder fra JSIS37 med enheder fra UIS-115.
Når du er færdig eksportere alle målinger og beregninger. For at måle muskel celle område åbne billedet i Fiji software og bruge polygon udvælgelse til omhyggeligt at spore omkring en enkelt skrå muskel celle. Juster polygonens linje i slutningen ved at trække ankerppunktet for at forbedre sporingen.
Gå til fanen Analysér øverst i softwaren, og klik på Mål for at beregne det markerede område. For muskelceller med et degenereret eller manglende område spores det manglende område med værktøjet til valg af polygon, og klik på Målér igen. Hvis der er flere huller, skal du spore hver enkelt separat.
Beregn forholdet mellem mellemrumsområdet og arealet af hele cellen. Et højt forhold indikerer en højere grad af muskeldegeneration. Og hvis der ikke mangler regioner, beregnes forholdet som nul.
Åbn Elastisk, og vælg Pixelklassifikation under Opret nyt projekt. Omdøb og gem derefter projektet. Gå til fanen inputdata, og klik på Tilføj ny, og tilføj derefter separate billeder.
Direkte pop op-vinduet til mappen med TIF-filerne, og vælg det ønskede billede. Klik på Vælg funktioner under fanen Valg af funktion for at vælge alle pixelfunktioner, der er angivet med de grønne markerede felter. Pixelmarkering i dette trin bruges til at skelne mellem de forskellige klasser af pixel i næste trin.
Brug et træningspanel til at skelne mellem de enkelte GFP-udtryk for myosinfilamenter og uønsket baggrund. Klik på Tilføj etiket og scrawl uønskede baggrunde og mellemrum mellem filamenter til at begynde klassificering uddannelse. Tilføj en anden etiket, omdøbe den til Filament, og scrawl over en række filamenter.
Klik på Live Update for at sikre, at klassificeringen er udført korrekt. Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje flere scrawls at finjustere uddannelsen. Når træningsklasseren er udført, skal du gå til panelet Forudsigelseseksport og klikke på Vælg Eksporter billedindstillinger med sandsynligheder som kilde.
Sørg for, at udskæringsunderregionerne x og y er afkrydset, og c er ikke-afmærket. Vælg nul og én som start- og stopværdier for c, og Konverter datatype til usigneret 8-bit. Sæt kryds Renormalize og derefter ændre output fil video til png, omdøbe filen og mappen som ønsket.
Luk vinduet Eksporter indstillinger, og eksportér det billede, der lige er blevet segmenteret. Åbn derefter png-filen i Fiji-software. Juster billedets tærskel ved hjælp af Standardindstillinger, og anvend plug-in'en for skeletonisering, som opretter en separat tabel med resultater.
Denne protokol er blevet brugt til at udforske funktionen af alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17 i synapse udvikling. Kvantitativ analyse af billeder af den bageste/ laterale mikrotubule eller PLM synapser indikerer, at overekspression af MEC-17 forstyrrer normal neuron funktion. Sammenlignet med den vilde type kontrol dyr overexpressing MEC-17 har reduceret præsynaptiske regioner og synaptisk integritet.
Disse teknikker er også blevet brugt til at analysere C.elegans modeller af Charcot-Marie-Tooth type 2 eller CMT2 regnskabsmæssige mutationer i CMT2-associerede gener. Visuel vurdering af kroppens vægmuskelmorfologi viste en 2,5 til 3,5 gange større forøgelse af defekter hos forsøgsdyrene sammenlignet med kontrol af vildtype. Dyr med mutationer i fzo-1 og unc-116 oplevet tab af muskeltriationer, ophobning af cellulære snavs, og muskelfiber degeneration.
Mens dyr med mutationer i dyn-1 oplevede betydeligt færre defekter i muskelmorfologi. De fzo-1 og unc-116 mutanter viste en fem til seks gange stigning i forholdet mellem hul og samlede enkelt celle område og en dramatisk kortere gennemsnitlig fiberlængde i forhold til vilde type dyr. For at der kan foretages sammenligninger mellem prøverne, er det vigtigt at fastlægge de mest optimale betingelser for billederhvervelse og sikre, at disse betingelser anvendes konsekvent.
Disse teknikker vil gøre det muligt for forskere at sammenligne morfologiske ændringer på tværs af forskellige genetiske baggrunde med kvantitative tilgange. Dette reducerer subjektiviteten og bidrager derfor til at forbedre repræsentereligheden af de genererede data.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.