Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides
Chapters
Summary September 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.
Transcript
Ion mobiliteitsmassaspectrometrie, of IM-MS, identificeert de verschillende producten ionen van de pH-afhankelijke redox en methylbindende reactie van peptiden. Met de moleculaire modellering van hun tertiaire structuur kan de metaalcorrelatie worden bepaald. IM-MS kan elk van de productionen oplossen en hun moleculaire samenstelling identificeren door tegelijkertijd hun massa-to-charge en aankomsttijden te meten en met betrekking tot hun stoichiometrie, protonatietoestand en conformatiestructuur.
Het ontwikkelen van klassen van metalen chelaatides zal leiden tot therapieën voor ziekten geassocieerd met metaalion misbalans, zoals de ziekte van Menkes en Wilson, kanker, en de ziekte van Alzheimer. Om te beginnen, reinig de ESI ingangsbuizen en naald capillaire grondig met ongeveer 500 microliters van 0,1 molaire glaciale azijnzuur, 0,1 molar ammoniumhydroxide, en ten slotte, gedeïoniseerd water. Gebruik native ESI-IM-MS voorwaarden zoals beschreven in het tekstprotocol om de negatieve en positieve ion im-MS spectra van de 10 ppm poly-DL-alanine oplossing te verzamelen gedurende 10 minuten per stuk.
Pipette 200.0 microliter van de 0,125 millimolar alternatieve methanobactine, of amb oplossing, in een 1,7 milliliter flacon. Verdun met 500 microliter gedeïsized water en meng de oplossing grondig. Pas de pH van het monster aan op 3.0 door 50 microliter 1,0 molaire azijnzuuroplossing toe te voegen.
Voeg 200,0 microliter van het 0,125 millimolar metaalion toe aan het voor de pH-gecorrigeerde monster. Voeg vervolgens gedeïverdgehouden water toe om een eindvolume van 1,00 milliliter van het monster op te leveren. Meng grondig, en laat het monster te equilibrate gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Met behulp van een stompe neusspuit, neem 500 microliters van het monster en het verzamelen van de negatieve en positieve ion ESI-IM-MS spectra voor vijf minuten per stuk. Gebruik de resterende 500 microliter van het monster om de uiteindelijke pH op te nemen met behulp van een gekalibreerde micro pH-elektrode. Herhaal deze stappen, behalve om de pH aan te passen aan pH vier, vijf, zes, zeven, acht, negen of tien, door nieuwe volumes azijnzuur of ammoniumhydroxideoplossingen toe te voegen.
Verzamel de negatieve en positieve ion ESI-IM-MS spectra van de resulterende oplossingen gedurende 10 minuten per stuk. Uit de IM-MS spectra, identificeren welke geladen soorten van de alternatieve methanobactine aanwezig zijn door ze te matchen met hun theoretische massa-to-charge isotopenpatronen. Open hiervoor MassLynx en klik op Chromatogram om het Chromatogram-venster te openen.
Ga naar het menu Bestand en Open om het gegevensbestand voor chatberichten te zoeken en te openen. Haal het IM-MS-spectrum eruit door met de rechtermuisknop te klikken, over het chromatogram te slepen en los te laten. Het spectrumvenster wordt geopend met het IM-MS-spectrum.
Klik in het spectrumvenster op Gereedschappen en isotopenmodel. Voer in het modelleervenster van isotoop de moleculaire formule van de amb-soort in, schakel het vak Opgeladen ionen weergeven in en voer de laadstatus in. Klik op OK. Herhaal dit proces om alle soorten in het IM-MS-spectrum te identificeren en hun massa-ladingisotoopbereik vast te leggen.
Voor elke amb-soort, scheid alle toevallige massa-to-charge soorten en extraheren hun aankomsttijd distributies, of ATD's, met behulp van hun massa-to-charge isotoop patronen om ze te identificeren. Open DriftScope en klik op Bestand en Openen om het IM-MS-gegevensbestand te zoeken en te openen. Gebruik de muis en links-klik om in te zoomen op de massa-to-charge isotoop patroon van de amb soort.
Gebruik het selectiegereedschap en de linkermuisknop om het isotooppatroon te selecteren. Klik op de knop Huidige selectie accepteren. Als u toevallige massa-to-charge soorten wilt scheiden, gebruikt u het selectiegereedschap en de linkermuisknop om de ATD-tijd te selecteren die isotooppatroon van de amb-soort heeft.
Klik op de knop Huidige selectie accepteren. Als u de ATD wilt exporteren, gaat u naar Bestand, Exporteren naar MassLynx. Selecteer vervolgens Drifttijd behouden en sla het bestand op in de juiste map.
Open het opgeslagen geëxporteerde bestand in het venster Chromatogram van MassLynx. Klik op Proces, Integreer in het menu, schakel het vak ApexTrack Peak Integration in en klik op OK. Neem de centroid en het geïntegreerde gebied van de ATD. Na het herhalen van dit proces voor alle opgeslagen amb en poly-DL-alanine IM-MS databestanden, gebruik de geïntegreerde ATD voor alle geëxtraheerde amb soorten van de positieve of de negatieve ionen op elk titratiepunt te normaliseren tot een relatief percentage schaal.
Voer hiervoor de identiteit van de amb-soort en hun geïntegreerde ATD bij elke pH in een spreadsheet. Gebruik voor elke pH de som van de geïntegreerde ATD's om de individuele amb-soort'ATD te normaliseren tot een procentuele schaal. Plot de procent intensiteiten van elke amb soort versus pH om te laten zien hoe de populatie van elke soort varieert als een functie van de pH.
Met behulp van een spreadsheet, zet de botsing dwarsdoorsnedes van poly-DL-alanine negatieve en positieve ionen gemeten in helium buffer gas om de gecorrigeerde botsing dwarsdoorsnedes. Zet vervolgens de gemiddelde aankomsttijden van de poly-DL-alanine calibrants en amb-soorten om in drifttijden. Sluit de poly-DL-alanine calibrants'drift tijden aan ten opzichte van hun gecorrigeerde botsdoorsneden.
Bepaal vervolgens, met behulp van een minste vierkanten regressiepasge, de A-priem- en B-waarden, waarbij A-priemgetal de correctie is voor de parameters voor temperatuur, druk en elektrische velden en B het niet-lineaire effect van het IM-apparaat compenseert. Met behulp van deze A prime en B waarden met de centroid drift tijden waarde, bepalen hun gecorrigeerde botsing dwarsdoorsnedes en hun botsing dwarsdoorsnedes. Deze methode biedt botsing dwarsdoorsnedes voor de peptide soorten met geschatte absolute fouten van ongeveer 2%Met behulp van Gaussian met GaussView, en de B3LYP LanL2DZ niveau van de theorie, lokaliseren geometrie geoptimaliseerde conformeerders voor alle mogelijke soorten coördinaties van de waargenomen massa-to-charge amb soorten.
De B3LYP LanL2DZ niveau van de theorie bestaat uit de Becke drie perimeter hybride functies, de Dunning basisset, en elektronenkern potentieel. Haal de thermochemische analyses van elk van de geoptimaliseerde conformeerders uit het Gaussische uitvoerbestand en bereken hun theoretische botsdoorsneden met behulp van de lennard-Jones-methode met ionenschaal uit het Sigma-programma. Van de laagste vrije energieconformers, bepaal welke conformer de lennard-Jones botsingskruisdoorsnede tentoonstelt die met de IM-MS gemeten botsingskruisdoorsnede akkoord gaat.
Dit proces identificeert de tertiaire structuur en het type coördinatie voor de conformeren die in het experiment worden waargenomen. Moleculaire modellering vereist vergelijking van de vrije energie en botsing dwarsdoorsnedes van conformisten met verschillende metalen chelaatplaatsen, cis en trans peptide bindingen, zoutbruggen, waterstof binding, en pi-cation interacties. De IM-MS studie van de alternatieve methanobactine toonde aan dat het zowel koper- als zinkionen op pH-afhankelijke wijze heeft gechelchelated, maar via verschillende reactiemechanismen en coördinatielocaties.
Zink(II)binding werd waargenomen bij een pH van meer dan zes, voornamelijk als een enkel negatief geladen complex, wat aangeeft dat het zink(II) te trahedrally werd gecoördineerd door de twee imidazolen en twee thiolaten. Koper(II)binding ging gepaard met de thiolen die een disulfidebrug vormden. Bij een pH van meer dan zes werd het enkel negatief geladen koper(II)-complex gevormd, wat aangeeft dat imidazool en twee gedeprotoneerde amide-stikstofs koper(II) coördineren, maar onder de pH zes vormde het toevoegen van koper(II) ook het enig positief geladen koper(I)-complex, evenals het enig positief geladen koper(II)complex boven pH zes.
Im-MS-onderzoeken van amb twee en amb vier tonen ook aan dat de koperreacties producten gaven die verschilden in het aantal inter- of intramoleculaire disulfidebruggen, het aantal koper(I)of koper(II)ionen en het aantal deprotonatielocaties, dat veranderde in functie van pH. Het IM-MS resultaat met moleculaire modellering toonde aan dat de alternatieve methanobactinen tot drie koperen(I)ionen konden coördineren via de thiolate, imidazolen en carboxylate groepen. De im-MS instrumentale instellingen moeten zorgvuldig worden gekozen om de peptiden'stoichiometrie, ladingsverdelingen en conformatiestructuren te behouden, zoals beschreven in de tekst.
De combinatie van een groter bereik van grootte die metaalcoördinatie zoals tyrosine bij aspartic zuur zal een beter begrip van de verhouding tussen structuur en functie zal beïnvloeden. IM-MS met moleculaire modellering zijn alternatieve technieken geworden om kristallografie en NMR-spectroscopie te versnellen voor het bepalen van de conformatiestructuren van eiwitten, DNA, lipiden en hun complexen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
