Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione
Chapters
Summary September 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
La spettrometria di massa io-masse ionica e le tecniche di modellazione molecolare possono caratterizzare le prestazioni selettive di chelatura metallica di peptidi progettati e la metanobattina peptide legante al rame. Lo sviluppo di nuove classi di peptidi chelanti metallici contribuirà a portare alle terapie per le malattie associate allo squilibrio degli ioni metallici.
Transcript
La spettrometria ionica di massa-mobilità, o IM-MS, identifica i vari ioni prodotti dal redox dipendente dal pH e dalla reazione di legame metile dei peptidi. Con la modellazione molecolare della loro struttura terziaria, è possibile determinare la correlazione metallica. L'IM-MS può risolvere ciascuno degli ioni prodotto e identificare la loro composizione molecolare misurando contemporaneamente i loro tempi di massa-carica e di arrivo e relativi alla loro stechiometria, stato di protonazione e struttura conformazionale.
Lo sviluppo di classi di peptidi chelanti metallici aiuterà a portare a terapie per malattie associate a squilibri ionici metallici, come il morbo di Menkes e Wilson, i tumori e il morbo di Alzheimer. Per iniziare, pulire accuratamente i tubi d'ingresso ESI e il capillare dell'ago con circa 500 microlitri di acido acetico glaciale molare 0,1, idrossido di ammonio molare 0,1 e, infine, acqua deionizzata. Utilizzare le condizioni ESI-IM-MS native come descritto nel protocollo di testo per raccogliere gli spettri IM-MS ionica negativi e positivi della soluzione poli-DL-alanina a 10 ppm per 10 minuti ciascuno.
Pipettare 200,0 microlitri della metanobactina alternativa da 0,125 millimolare, o soluzione di ambrogio, in una fiala da 1,7 millilitro. Diluire con 500 microlitri di acqua deionizzata e mescolare accuratamente la soluzione. Regolare il pH del campione a 3.0 aggiungendo 50 microlitri di soluzione di acido acetico molare 1.0.
Aggiungere 200,0 microlitri dello ione metallico da 0,125 millimolare al campione regolato con pH. Quindi, aggiungere acqua deionizzata per produrre un volume finale di 1,00 millilitro del campione. Mescolare accuratamente e lasciare che il campione equilibra per 10 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando una siringa per naso smussato, prendere 500 microlitri del campione e raccogliere gli spettri ion negativi e positivi ESI-IM-MS per cinque minuti ciascuno. Utilizzare i restanti 500 microlitri del campione per registrare il suo pH finale utilizzando un elettrodo micro pH calibrato. Ripetere questi passaggi, tranne per regolare il pH a pH quattro, cinque, sei, sette, otto, nove o 10, aggiungendo nuovi volumi di acido acetico o soluzioni di idrossido di ammonio.
Raccogliere gli spettri ion negativi e positivi ESI-IM-MS delle soluzioni risultanti per 10 minuti ciascuno. Dagli spettri IM-MS, identificare quali specie cariche della metanobactina alternativa sono presenti abbinandole ai loro modelli teorici di isotopo da massa a carica. A tal fine, aprite MassLynx e fate clic su Cromatogramma (Chromatogram) per aprire la finestra Cromatogramma (Chromatogram).
Passare al menu File e aprire per individuare e aprire il file di dati IM-MS. Estrarre lo spettro IM-MS facendo clic con il pulsante destro del mouse, trascinandolo sul cromatogramma e rilasciandolo. La finestra dello spettro si aprirà, mostrando lo spettro IM-MS.
Nella finestra dello spettro, fate clic su Strumenti (Tools) e Modello isotopico (Isotope Model). Nella finestra di modellazione isotopica, immettere la formula molecolare della specie amb, selezionare la casella Mostra ioni caricati e immettere lo stato di carica. Fare clic su OK. Ripetere questo processo per identificare tutte le specie nello spettro IM-MS e registrare il loro areale isotopico da massa a carica.
Per ogni specie di amb, separare qualsiasi specie casuale da massa a carica ed estrarre le loro distribuzioni dell'orario di arrivo, o ATD, utilizzando i loro modelli isotopici da massa a carica per identificarle. Aprite DriftScope e fate clic su File e apri (Open) per individuare e aprire il file di dati IM-MS. Usa il mouse e fai clic con il pulsante sinistro del mouse per ingrandire il modello isotopico da massa a carica della specie amb.
Utilizzate lo strumento selezione e il pulsante sinistro del mouse per selezionare il motivo isotopico. Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente. Per separare qualsiasi specie casuale da massa a carica, utilizzare lo strumento di selezione e il pulsante sinistro del mouse per selezionare il tempo ATD allineato con il modello isotopico della specie amb.
Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente. Per esportare l'ATD, passare a File, Esporta in MassLynx. Quindi selezionare Mantieni tempo di deriva e salvare il file nella cartella appropriata.
Nella finestra Cromatogramma di MassLynx aprire il file esportato salvato. Fate clic su Processo (Process), Integra (Integrate) dal menu, selezionate la casella Integrazione picco ApexTrack (ApexTrack Peak Integration) e fate clic su OK. Registrare il baricentro e l'area integrata dell'ATD. Dopo aver ripetuto questo processo per tutti i file di dati IM-MS amb e poly-DL-alanina salvati, utilizzare l'ATD integrato per tutte le specie di amb estratte degli ioni positivi o negativi in ogni punto di titolazione per normalizzarsi su una scala percentuale relativa.
Per fare ciò, inserisci le identità delle specie di amb e il loro ATD integrato ad ogni pH in un foglio di calcolo. Per ogni pH, utilizzare la somma degli ATD integrati per normalizzare l'ATD delle singole specie di amb su una scala percentuale. Traccia le intensità percentuali di ogni specie di amb rispetto al pH per mostrare come la popolazione di ogni specie varia in funzione del pH.
Utilizzando un foglio di calcolo, convertire le sezioni trasversali di collisione degli ioni negativi e positivi poli-DL-alanina misurati nel gas tampone di elio nelle sezioni trasversali di collisione corrette. Quindi, convertire i tempi medi di arrivo dei calibranti poli-DL-alanina e delle specie di am in tempi di deriva. Collegare i tempi di deriva dei calibranti poli-DL-alanina rispetto alle sezioni trasversali di collisione corrette.
Quindi, utilizzando un adattamento di regressione dei quadrati minimo, determinare i valori A prime e B, dove Un primo è la correzione per i parametri di temperatura, pressione e campo elettrico, e B compensa l'effetto non lineare del dispositivo di messaggistica istantanea. Utilizzando questi valori A prime e B con il valore dei tempi di deriva baricentro, determinare le sezioni trasversali di collisione corrette e le sezioni trasversali di collisione. Questo metodo fornisce sezioni trasversali di collisione per le specie peptidiche con errori assoluti stimati di circa il 2%Utilizzando gaussiano con GaussView e il livello teorico B3LYP LanL2DZ, individuare conformiri ottimizzati per la geometria per tutti i possibili tipi di coordinazioni della specie amb di massa-carica osservata.
Il livello teorico di B3LYP LanL2DZ è composto dai tre funzionali ibridi perimetrali di Becke, dal set di basi di Dunning e dai potenziali del nucleo elettronico. Estrarre le analisi termochimiche di ciascuno dei conformiri ottimizzati dal file di uscita gaussiano e calcolare le loro sezioni trasversali di collisione teoriche usando il metodo Lennard-Jones scalato dagli ioni dal programma Sigma. Dai conformiri a energia libera più bassa, determinare quale conformere mostra la sezione trasversale di collisione di Lennard-Jones che concorda con la sezione trasversale di collisione misurata im-MS.
Questo processo identifica la struttura terziaria e il tipo di coordinazione per i conformiri osservati nell'esperimento. La modellazione molecolare richiede il confronto delle sezioni trasversali di energia libera e collisione di conformi con diversi siti di chelating metallico, legami cis e trans peptidici, ponti di sale, legame idrogeno e interazioni di pi-cation. Lo studio IM-MS del metanobactin uno alternativo ha dimostrato che esso ha chelato sia ioni di rame che di zinco in modo dipendente dal pH, ma attraverso diversi meccanismi di reazione e siti di coordinamento.
Il legame zinco(II) è stato osservato ad un pH superiore a sei, formando principalmente un unico complesso caricato negativamente, indicando che lo zinco(II) è stato tetraedrolmente coordinato dai due imidazoli e due tiolati. Il legame rame(II) era accompagnato dai tioli che formavano un ponte disolfuro. Con un pH superiore a sei, si è formato il singolo complesso di rame(II) caricato negativamente, che indicava l'imidazolo e due azoto ammide deprotonato coordinavano il rame(II)Tuttavia, al di sotto del pH sei, l'aggiunta di rame(II) formava anche il singolo complesso di rame caricato positivamente(I), così come il singolo complesso di rame caricato positivamente (II) sopra il pH sei.
Studi IM-MS di amb two e amb four mostrano anche che le reazioni di rame hanno dato prodotti che differivano nel numero di ponti disolfuro inter-o intramolecolari, numero di ioni rame(I) o rame(II) e numero di siti di deprotonazione, che cambiarono in funzione del pH. Il risultato IM-MS con la modellazione molecolare ha mostrato che le metanombine alternative potevano coordinare fino a tre ioni rame(I) attraverso i gruppi tiolato, imidazolo e carbossilato. Le impostazioni strumentali IM-MS devono essere scelte con cura per conservare la stechiometria dei peptidi, le distribuzioni di carica e le strutture conformazionali, come descritto nel testo.
La combinazione di una gamma più ampia di dimensioni che influenzerà la coordinazione metallica come la tirosina nell'acido aspartico consentirà una maggiore comprensione della relazione tra struttura e funzione. L'IM-MS con modellazione molecolare sono diventate tecniche alternative per accelerare la cristallografia e la spettroscopia NMR per determinare le strutture conformazionali di proteine, DNA, lipidi e i loro complessi.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
