Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды
Chapters
Summary September 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Ионно-массовая спектрометрия и методы молекулярного моделирования могут характеризовать селективное металлическое хелативирование производительности разработанных металлосвязывающих пептидов и медно-связывающего пептида метанобактина. Разработка новых классов металлических хелатных пептидов поможет привести к терапии заболеваний, связанных с дисбалансом ионов металла.
Transcript
Ионная мобильность-масс-спектрометрия, или IM-MS, идентифицируют различные ионы продуктов из рН-зависимой редокса и метилобязательной реакции пептидов. При молекулярном моделировании их третичной структуры можно определить корреляцию металла. IM-MS может решить каждый из ионов продукта и определить их молекулярный состав путем одновременно измерять их время масс-к-заряда и прибытия и relating to их stoichiometry, положение протонации, и конформациальная структура.
Разработка классов металлических хелатирующих пептидов поможет привести к терапевтическим заболеваниям, связанным с дисбалансом ионов металла, таким как болезнь Менкеса и Уилсона, рак и болезнь Альцгеймера. Для начала тщательно очистите входные трубки ESI и капилляр иглы примерно с 500 микролитров 0,1 молярной ледниковой уксусной кислоты, 0,1 гидроксида молярного аммония и, наконец, деионизированной воды. Используйте родные условия ESI-IM-MS, описанные в текстовом протоколе, для сбора отрицательных и положительных ионных спектров IM-MS 10 ppm поли-DL-аланина решения в течение 10 минут каждый.
Пипетка 200.0 микролитров 0,125 миллимолярный альтернативный метанобактин, или амб раствор, в 1,7 миллилитров флакона. Разбавить 500 микролитров деионизированной воды и тщательно перемешать раствор. Отрегулируйте рН образца до 3,0, добавив 50 микролитров раствора 1,0 молярной уксусной кислоты.
Добавьте 200,0 микролитров иона металла 0,125 миллимолара в скорректированный рН образец. Затем добавьте деионизированную воду, чтобы получить окончательный объем в 1,00 миллилитров образца. Тщательно перемешайте и дайте образцу равноденствие в течение 10 минут при комнатной температуре.
Используя тупой шприц носа, возьмите 500 микролитров образца и соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS в течение пяти минут каждый. Используйте оставшиеся 500 микролитров образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброванного микро-электрода рН. Повторите эти шаги, за исключением корректировки рН до рН четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10, добавив новые объемы уксусной кислоты или гидроксида аммония решений.
Соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS полученных решений в течение 10 минут каждый. Из спектра IM-MS определите, какие заряженные виды альтернативного метанобактина присутствуют, сопоставляя их с их теоретическими изотопами массы к зарядке. Для этого откройте MassLynx и нажмите на хроматограмму, чтобы открыть окно Хроматограммы.
Перейдите в меню File и Откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Извлекайте спектр IM-MS, нажимая правой кнопкой мыши, перетаскивая хроматограмму и выпуская. Откроется окно спектра, показывающее спектр IM-MS.
В окне спектра нажмите на инструменты и изотопную модель. В окне моделирования Isotope введите молекулярную формулу вида амб, проверьте заряженную ионовую коробку Show и введите состояние заряда. Нажмите OK. Повторите этот процесс, чтобы идентифицировать все виды в спектре IM-MS и зафиксировать их диапазон изотопов массы до заряда.
Для каждого вида амб, отделить любые случайные массы к зарядке видов и извлечь их распределения времени прибытия, или ATDs, используя их массы к зарядке изотопов моделей для их идентификации. Откройте DriftScope и нажмите на файл и откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Используйте мышь и левым щелчком мыши, чтобы увеличить масштаб массы до зарядки изотопного узора вида амб.
Используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать изотопный шаблон. Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Чтобы отделить любые случайные виды массы к зарядке, используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать время ATD, приведенную в соответствие с изотопным рисунком вида амб.
Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Для экспорта ATD, перейдите на файл, экспорт в MassLynx. Затем выберите Сохранить время дрейфа и сохранить файл в соответствующую папку.
В окне Chromatogram MassLynx откройте сохраненный экспортируемый файл. Нажмите на process, Интегрируйте из меню, проверьте поле ApexTrack Peak Integration и нажмите OK. Запись центроида и интегрированной области ATD. После повторения этого процесса для всех сохраненных файлов данных amb и poly-DL-alanine IM-MS, используйте интегрированный ATD для всех извлеченных видов amb или положительных или отрицательных ионов на каждом пункте титрования для того чтобы нормализовать к относительной шкале процента.
Для этого введите идентичности вида амб и их интегрированного ATD при каждом рН в электронную таблицу. Для каждого рН используйте сумму интегрированных ПДД для нормализации отдельных amb species'ATD в процентном соотношении. Участок процент интенсивности каждого вида амб по сравнению с рН, чтобы показать, как популяция каждого вида варьируется в зависимости от функции рН.
Используя электронную таблицу, преобразуете поперечные сечения поли-DL-аланина отрицательные и положительные ионы, измеренные в буферном газе гелия, в исправленные поперечные сечения столкновения. Затем преобразуем среднее время прибытия поли-DL-аланин-калибрантов и амб видов в дрейф раз. Подключите поли-DL-аланин calibrants'drift раз по сравнению с их исправлены столкновения поперечных сечений.
Затем, используя наименее квадратную регрессию, определите значения A prime и B, где прайм является коррекцией параметров температуры, давления и электрического поля, а B компенсирует нелинейный эффект устройства чата. Используя эти значения A prime и B с значением времени дрейфа центроидов, определите их исправленные поперечные сечения столкновения и поперечные сечения столкновения. Этот метод обеспечивает столкновение поперечных сечений для пептидных видов с оценками абсолютных ошибок около 2%Использование Gaussian с GaussView, и Уровень теории B3LYP LanL2D, найти геометрии оптимизированных конформеров для всех возможных типов координации наблюдаемых масс-к-заряда амб видов.
Теория теории B3LYP LanL2D состоит из трех гибридных функциональных элементов периметра Becke, набора основ Даннинга и потенциалов электронного ядра. Извлекайте термохимический анализ каждого из оптимизированных конформеров из гауссийского выходного файла и вычисляйте их теоретические поперечные сечения столкновений с помощью ионно-масштабного метода Леннарда-Джонса из программы Sigma. От самых низких свободных конформеров энергии, определить, какой конформист экспонатов Леннард-Джонс столкновения поперечного сечения, что согласен с IM-MS измеряется столкновения поперечного сечения.
Этот процесс определяет третичную структуру и тип координации для конформистов, наблюдаемых в эксперименте. Молекулярное моделирование требует сравнения свободной энергии и столкновения поперечных сечений конформеров с различными металлическими хелатирующими участками, cis и транс-пептидными связями, соляными мостами, водородными связями и пи-катионом взаимодействий. Исследование альтернативного метанобактина, проведенное IM-MS, показало, что он хелатировал ионы меди и цинка в зависимости от рН образом, но с помощью различных механизмов реакции и координационных участков.
Связывание цинка (II) наблюдалось при рН более шести, в основном образуя единый отрицательно заряженный комплекс, указывающий на то, что цинк (II) был тетрагедрально скоординирован двумя имидазолами и двумя тиолатами. Медь (II) связывание сопровождалось тиолами, образующими дисульфидный мост. При рН более шести образовался единый отрицательно заряженный медный (II) комплекс, указывающий на то, что имидазол и два депротонированных амидных азота координировали медь (II)Однако, ниже рН шесть, добавив медь (II), также образовался единый положительно заряженный медный (I)комплекс, а также единый положительно заряженный медный (II)комплекс выше рН шесть.
Im-MS исследования амб два и амб четыре также показывают, что медные реакции дали продукты, которые отличаются по количеству меж- или внутримолекулярных дисульфидных мостов, количество меди (I) или меди (II) ионов, а также количество сайтов депротонации, которые изменились в зависимости от функции рН. Результат IM-MS с молекулярным моделированием показал, что альтернативные метанобактины могут координировать до трех медных (I) ионов через тиолат, имидазолы и карбоксилатные группы. Инструментальные настройки IM-MS должны быть тщательно подобраны для сохранения пептидов'stoichiometry, распределения заряда, и конформации структур, как описано в тексте.
Сочетание более широкого диапазона размеров, которые будут влиять на координацию металла, таких как тирозин на аспарагиновой кислоты позволит лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией. IM-MS с молекулярным моделированием стали альтернативными методами ускорения кристаллографии и спектроскопии ЯМР для определения конформативных структур белков, ДНК, липидов и их комплексов.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
