Login processing...

JoVE Journal
Genetics

This content is Open Access.

JoVE Journal Genetics

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Journal (Genetics)

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Journal (Genetics)

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Click here for the English version

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

Article DOI: 10.3791/60130-v

September 1st, 2019 •

Chi-Keung Cheng¹, Terry H.Y. Wong¹, Yuk-Lin Yung¹, Nelson C.N. Chan¹, Margaret H.L. Ng^1,2

¹Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, ²State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 1st, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Direkte levering af præmonterede Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er et hurtigt og effektivt middel til genomredigering i hæmatopoietiske celler. Her bruger vi denne tilgang til at slette en RUNX1 intronic lyddæmper og undersøge de transkriptionelle svar i OCI-AML3 leukæmiceller.

Transcript

Cis-regulerende elementer som initiativtagere og smagsforbedre er vigtige determinanter for genekspression. Traditionelle tilgange til at studere disse elementer er besværlige og involverer ofte brugen af heterologe reporter gener. Her demonstrerer vi brugen af CRISPR til at undersøge den transskriptionelle rolle af en RUNX1 intronic lyddæmper i leukæmi cellelinje.

Protokollen er enkel at udføre og giver mulighed for hurtige vurderinger af genregulerende funktioner i den endogene genkontekst. Hæmatopoietiske celler er ofte vanskelige at transfekt med en plasmid baseret metoder. I denne protokol bruger vi elektroporationen til at levere formonteret Cas9, guide RNA, komplekser ind i cellerne.

Fordelene ved denne tilgang omfatter anvendelse af forbedret redigeringseffektivitet og celle levedygtighed samt reduceret off-target effekter. Den efterfølgende brug af fragmentanalyse muliggør også enkel og hurtig screening af de ønskede mutantkloner fra en stor mængde prøver. Demonstration af proceduren vil være Yuk-Lin Yung, tekniker for mit laboratorium.

Begynd med at designe to CRISPR RNAs, en fem prime og de tre andre prime af målet cis-lovgivningsmæssige element, eller CRE. Sørg for, at en PAM af NGG er placeret umiddelbart efter målsekvensen for Cas9-genkendelse. For at danne gRNA-komplekset skal du kombinere CRISPR RNA og tracer RNA i TE-buffer i henhold til manuskriptretninger for en endelig duplekskoncentration på 44 mikromolar.

Inkuber blandingen ved 95 grader celsius i fem minutter og lad den køle af til stuetemperatur. Rekombinanten Cas9-nuklease fortyndes med PBS for en endelig nukleasekoncentration på 36 mikromolar. Bland derefter et tilsvarende volumen af den fortyndede nuklease med hver af gRNA duplexes og inkuber dem i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade RNP kompleks til at danne.

Centrifuge 2,5 millioner celler i et 1,5 milliliterrør ved 500 gange g i fem minutter. Derefter kasseres supernatant og re-suspendere cellerne i 163 mikroliter af RPMI 1640 medium uden phenol rød. Tilføj 16,7 mikroliter af RNP-komplekset og 3,6 mikroliter af 100 mikromolarelektroporationsforstærker til cellerne og overfør blandingen til en 0,2 centimeter-gap elektroporation cuvette, idet der skal være pasning af ikke at indføre bobler.

Elektroporate cellerne og overføre dem til en T-25 vævskulturkolbe indeholdende 6 milliliter komplet RPMI 1640-medium. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. En dag efter elektroporationen fortyndes cellerne til 5000 celler pr. milliliter i komplet RPMI 1640-medium.

Og tilsæt 100 mikroliter af cellesuspensionen i hver brønd på en 96-brønd vævskulturplade. Kultur cellerne i syv til 14 dage derefter udtrække genomisk DNA ved hjælp af en høj-throughput rensningssystem. Der tilsættes 100 mikroliter pladebinding og lysisbuffer til hver brønd af en 96-veludslettet ekstraktionsplade efterfulgt af 50.000 celler, der er suspenderet igen i 10 mikroliter PBS.

Bland brøndens indhold ved pipettering op og ned. Inkuber pladen ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade det genomiske DNA at binde sig til brøndene. Derefter forsigtigt aspirere opløsningen fra brøndene og vask dem med 120 mikroliter af vask buffer.

Lufttørre pladen. Tilføj 20 mikroliter PCR mix til hver brønd og køre PCR i henhold til manuskript retninger. Når forstærkningen er færdig, skal produktet anslås ved at måle koncentrationen af et udvalgt antal prøver med et fluorometer.

Alle prøver fortyndes til 0,5 nanogram pr. mikroliter med nukleasefrit vand. Bland en mikroliter af det fortyndede PCR-produkt med 8,5 mikroliter af deioniseret formamid og 0,5 mikroliter af fluorescerende farvestofmærket størrelsesstandard i en 96-brøndsplat, der er kompatibel med den genetiske analysator. Dæk pladen med en plade septa og deature prøverne ved 95 grader Celsius i tre minutter i en termocykator.

Udfør kapillær elektroforese for at adskille de mærkede PCR-produkter og analysere resultaterne på analysesoftwaren. Kontroller det orange ikon for at få vist de mærkede fragmenter og størrelsesstandarden for at vurdere kvaliteten af størrelsesopkald. Kontroller derefter det blå ikon for at få vist de mærkede PCR-produkter.

Identificer de toppe, der svarer til produkter af vildtype og mutant, og anslå mutantniveauet i hver prøve ved at dividere arealet under den mutante top med summen af arealet under de vilde og mutante toppe. Vælg flere cellepuljer med høje niveauer af de forventede sletninger for yderligere serielle fortyndinger. Gentag DNA-ekstraktion, fluorescerende PCR, og kapillær elektroforese trin og vælge kloner med mutant niveauer større end 95% for efterfølgende analyse.

Uddrag total RNA fra de valgte kloner og udføre gratis DNA syntese. Bland RNA med en poly-T primer og dNTPs i henhold til manuskript retninger og inkubere ved 65 grader Celsius i fem minutter. Derefter placere reaktionen på is i mindst et minut.

Tilføj ti mikroliter af cDNA syntese mix til reaktionen. Derefter inkubere prøven ved 50 grader Celsius i 50 minutter og 85 grader Celsius i fem minutter i en termocyr. Efter cDNA syntese, behandle prøverne med en mikroliter af RNase H og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 20 minutter.

Design primere og TaqMan sonder specielt til individuelle udskriftsvarians genereret fra alternative promotorer og klon dna-fragmenter, der indeholder de specifikke udskriftssekvenser i plasmid DNA. Lav en tidobbelt fortynding serie af rekombinant plasmider som standard kurver til udskrift kvantificering. Forbered 20 mikroliter PCR mix for hver prøve og køre realtid PCR i henhold til manuskript retninger.

Analysér resultaterne, og normaliser kopinummeret på måludskrifterne i hver prøve med et rengøringsgen. Denne protokol er blevet anvendt til at slette RUNX1 intronic lyddæmper og sletningen blev bekræftet med kapillær gel elektroforese. De forventede størrelser af wild-type og mutant PCR produkter er omkring 500 base par og 230 base par henholdsvis.

Størrelsen af de mutante produkter kan variere blandt klonerne på grund af indels dannet på spaltningsstederne. Sanger sekvensering blev brugt til at bekræfte identiteten af sletningerne. RUNX1 genet indeholder to initiativtagere, P1 og P2, som producerede tre store mRNA udskrifter: RUNX1c af P1, og RUNX1a og RUNX1b af P2. Kvantitativ PCR i realtid kan bruges til at bestemme, hvordan sletningen af lyddæmperelementet påvirker udtrykket af disse udskrifter.

Et godt design af CRISPR RNAs er vigtigt for dets vurdering af eksperimentet. Sørg for, at CRSIPR RNA er pakket tæt til det ønskede sletningsområde. Sørg også for, at en PAM-sekvens er placeret neden for målsekvensen for Cas9-genkendelse.

Ud over at studere CREs kan denne strategi bruges til undersøgelser af genlokation og fungerer som et alternativ til RNA-interferens til at undersøge genfunktioner. Ved at kombinere med kromosom kropsbygning fangst teknikker CRISPR vil helt sikkert hjælpe dechifrere engagementer af CREs i den ændrede genom organisation og genekspression knyttet til forskellige sundhedsproblemer som kræft.

X

Simple Hit Counter