Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Questo protocollo descrive tre saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventricolari umane e la loro interazione con internatori GABAergici umani. I risultati di questi test forniranno una visione critica del legame tra cellule endoteliali periventricolari e disturbi cerebrali. Questi test sono semplici, a basso costo e consentono la misurazione della migrazione cellulare nell’intervallo di centimetri, che non è ottenuta da altri saggi esistenti.

Difetti nella migrazione e distribuzione degli internauri GABAergici sono associati a disturbi psichiatrici, come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione. Pertanto, è fondamentale studiare l’interazione delle cellule endoteliali periventricolari con internauri gabaergici nel contesto umano per affrontare la patogenesi di questi disturbi. Inizia preparando le cellule umane per il saggio.

Consentire alle cellule endoteliali periventricolari umane di raggiungere il 70-80% di confluenza, quindi dissociarle secondo le indicazioni del manoscritto e contarle usando il metodo di esclusione blu del trypan. Per preparare internauri GABAergici umani, soluzione di dissociazione cellulare calda e un’aliquota di mezzo neuronale a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aspirare il mezzo da ogni cellule ben contenenti e lavarle con un millimetro di PBS per pozzo.

Staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di dissociazione prebelliche per pozzo e incubandole a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l’incubazione, aggiungere un millilitro di mezzo neuronale per pozzo e trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri, triturando delicatamente per dissociare i grumi cellulari. Centrifugare le cellule a 380 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di mezzo neuronale.

Quindi contare le celle vive usando l’esclusione blu trypan. Preparare il controllo delle cellule endoteliali umane riscaldando la soluzione di dissociazione cellulare e un’aliquota di mezzo endoteliale a 37 gradi celsius, 10 minuti prima dell’uso. Aspirare il mezzo da ogni pozzo e lavarli con un millilitro di PBS per pozzo.

Staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri della soluzione di dissociazione prebellica ad ogni pozzo e incubando la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo cellulare endoteliale per pozzo per neutralizzare la soluzione di dissociazione e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 volte G per cinque minuti, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo cellulare endoteliale.

Utilizzare quindi il metodo di esclusione trypan per contare le celle. Preparare un inserto di coltura del pozzo tagliando tre lati di un pozzo di un inserto in coltura in silicone a due po po’, con una lama sterile. Rimuovere l’inserto con pinzette sterili e posizionarlo al centro di un piatto rivestito in poli-L-ornitina e laminina, quindi premere lungo il bordo dell’inserto per fissarlo alla superficie.

Capovolgere con cura il piatto per verificare che l’inserto sia saldamente aderendo e contrassegnare il bordo del vano inserto utilizzando un mercato nero permanente con una punta ultra fine. Sospendere gli internauri gabaergici umani in cellule endoteliali periventricolari neuronali e umane e nel mezzo cellulare endoteliale a una concentrazione di 30.000 per 70 microlitri, quindi seminare 70 microlitri della soluzione cellulare all’interno di ogni inserto di coltura del pozzo. Aggiungere un millilitro di mezzo neuronale al piatto neuronale per riempire l’area intorno all’inserto e impedire l’essiccazione del rivestimento.

Allo stesso modo, aggiungere un millilitro di mezzo cellulare endoteliale al piatto cellulare endoteliale periventricolare. Controllare le cellule al microscopio per verificare che non perdano dal vano inserto, quindi incubarle a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l’incubazione, controllare nuovamente le cellule al microscopio per verificare che siano state correttamente attaccate.

48 ore dopo la semina, rimuovere delicatamente l’inserto con pinzette sterili e controllare le cellule al microscopio per verificare che lo strato cellulare rimanga indisturbato. Rimuovere il mezzo sia dal neurone che dai piatti cellulari endoteliali periventricolari e aggiungere un millilitro di mezzo fresco ad ogni piatto. Incubare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni.

Quindi, rimuovere il supporto, fissare le celle con 4%PFA per 10 minuti e lavarle tre volte con PBS. Per eseguire il saggio di co-coltura, sospendere 30.000 internauri GABAergici e 30.000 cellule endoteliali periventricolari umane in 70 microlitri di mezzo co-coltura, quindi seminare questa soluzione cellulare all’interno di un compartimento ben inserito. Dopo 48 ore, rimuovere l’inserto.

Incubare la co-coltura a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Dopo l’incubazione, rimuovere il mezzo, fissare le cellule con il 4%PFA e lavarle tre volte con PBS. Per eseguire il saggio chemio-attrazione, posizionare un inserto di coltura di tre pozzi al centro di un piatto di 35 millimetri rivestito in poli-L-ornitina e laminina, capovolgere il piatto e contrassegnare il confine intorno al compartimento centrale dell’inserto utilizzando un pennarello permanente con una punta ultra fine.

Seme 30.000 internauri GABAergici in 70 microlitri di mezzo neuronale nel compartimento centrale, quindi seme 10.000 cellule endoteliali periventricolari e 10.000 controllano le cellule endoteliali e 70 microlitri del rispettivo mezzo nei due compartimenti esterni. Aggiungere un millilitro di mezzo co-coltura lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento sul piatto si asciughi. Dopo 48 ore, rimuovere l’inserto e incubare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per 36 ore.

Dopo l’incubazione, rimuovere il mezzo, fissare le cellule e lavarle tre volte con PBS. Test di migrazione a lunga distanza e co-coltura sono stati utilizzati per indagare le interazioni tra le cellule endoteliali periventricolari e i neuroni GABAergici. Nel saggio sulla migrazione a lunga distanza, le cellule sono iniziate come una patch rettangolare il giorno zero, ma di 48 ore, erano migrate nello spazio privo di celle.

La colorazione immunocitochimica con anticorpo Anti-Active Caspase-3, un marcatore di apoptosi, non ha mostrato alcun segnale apoptotico nei neuroni seminati. Nel saggio di migrazione della co-coltura, quando gli internauroni venivano co-seminati con cellule endoteliali periventricolari umane, i neuroni percorrevano distanze più lontane rispetto a quando gli internauroni venivano seminati da soli o quando co-seminati con cellule endoteliali di controllo. Nel saggio chemio-attrazione, un numero significativamente più elevato di internauroni migrò verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali, confermando che gli internauri gabaergici rispondono selettivamente a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventricolari.

Questi saggi possono essere modificati usando ligandi, inibitori o areni di dosaggio per ottenere intuizioni meccaniche sulle interazioni delle cellule endoteliali periventricolari umane con internauri umani. Possono anche essere usati per studiare l’interazione delle cellule endoteliali periventricolari umane con altre cellule neurali come riportato dal nostro gruppo e da altri. Quando si tenta questa procedura, è importante fissare saldamente l’inserto sul piatto e tenerlo indisturbato durante tutto il saggio, altrimenti potrebbe portare a perdite cellulari, distacco della cella o disallineamento dell’inserto con il limite disegnato.

Il nostro lavoro ha indicato il ruolo autonomo cellulare delle cellule endoteliali periventricolari umane nella patogenesi di disturbi psichiatrici come schizofrenia, epilessia e autismo. Questi test consentiranno quindi la valutazione delle cellule endoteliali periventricolari masate derivate da pazienti con questi disturbi utilizzando la tecnologia IPSC.