Cancer Research
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell
Chapters
Summary March 20th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette arbeidet forhåndsinnpeker en avansert protokoll for å nøyaktig vurdere tumorlasting ved påvisning av grønt fluorescerende protein og bioluminescenssignaler samt integrering av kvantitativ molekylær deteksjonsteknikk.
Transcript
Vår protokoll overvinner det begrensede bioluminescensbildevinduet ved å inkludere en GFP-kode som også forenkler deteksjon og kvantifisering av mikrometastase ved PCR-analyse. Fordi GFP-taggen omgår det begrensede bioluminescensoppkjøpsvinduet, kan flere emner avbildes uten signaltap, og potensialet for falske negative resultater er begrenset. Denne studien vil være nyttig for forskere for evaluering av terapeutisk effekt av anti-kreftmidler.
Denne metodikken gir en nyttig modell for forskere som er interessert i EMT, legemiddelresistens og kreftstamcellemekanismer knyttet til den metastatiske prosessen, så vel som for utvikling av kreftmedisiner. Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks, vattpinne venstre fjerde brystkjertel med alkohol og bruk fine rotte-tann tang for å løfte den fjerde brystkjertelen litt. Pass på at spissen er skråkant opp, sett inn en 25 gauge nål festet til en en en milliliter sprøyte som inneholder 100 mikroliter av celle kjeller membran matrise blanding og litt trekke stempelet for å sikre at nålen ikke kommer i kontakt med noen blodkar.
For komparative resultater må tumorcelleinjeksjonsstedet være konsistent blant alle mottakerdyrene. Hvis det ikke kommer blod inn i sprøyten, må du sakte injisere hele oppløsningsvolumet i fettputen for pattedyr. En rund hevet masse vil vises under huden.
Vent 10 til 15 sekunder på at kjellermembranmatrisen herdes før du fjerner nålen og lar xenograften vokse fritt uten avbrudd i syv til 10 dager før du utfører en måling av tumorstørrelse. Bruk deretter kalipere til å måle størrelsen på xenograften i alle musene og bestemme tumorvolumet ved hjelp av ligningen som angitt. Før avbildning av studiedyrene, bilde tre ekstra tumorbærende mus i 40 minutter med to minutters intervaller ved hjelp av parametrene som er angitt for å oppnå luciferin kinetikk for studien.
Bruk det målte bioluminescenssignalet til å definere det optimale tidsvinduet for bildeanskaffelse for alle de påfølgende tidspunktene. For å utføre metastaseavbildning, dekk den primære svulsten med et ermet kuttet fra en svart hanske og plasser en bedøvet mus inn i skanneren og deretter bilde luciferin signalet ved hjelp av de samme parametrene som nettopp demonstrert med ventral side av musen mot kameraet for lungemetastase avbildning og dorsal side av musen mot kameraet for hjernen metastase imaging. Ved hjelp av en skanner- og dataanalyseprogramvare trekker du en interesseregion over det avbildede området for å sikre at hele interesseorganet dekkes for å tillate evaluering av den metastatiske byrden og kvantifisere bioluminescensproduksjonen som total fluks og fotoner per sekund.
Umiddelbart etter bioluminescens signal kvantifisering, høste hjernen og lungevev og skyll raskt organene i PBS for å fjerne eventuelle overfladiske blodflekker. Plasser organene på en svart plastplate med lav lysfluscens og transporter prøvene til en multispektral fluorescensskanner utstyrt med spektral unmixing evne for GFP-deteksjon. For å skaffe multispektrale GFP-bilder av de ekstraherte organene, skann organene fra 500 til 720 nanometer med trinnstørrelse på 10 nanometer.
For å oppnå vev automatisk fluorescens profil, skanne utskåret organer av uinjiserte kontrollmus. I tillegg bilde GFP positive vev som primær svulst for å skaffe auto fluorescens blandet GFP profil. Behandle disse spektraene i henhold til produsentens protokoll for å etablere et spektralt bibliotek med rene GFP- og autofluorescensprofiler.
Etter å ha bekreftet nøyaktigheten av spektralbiblioteket og separering av GFP-signal fra vev automatisk fluorescens bakgrunn, bruke det samme biblioteket for å unmix alle bilder på studien. For DNA-ekstraksjon etter snap frysing, plasser hele hjernen i et fem milliliter homogeniserende rør som inneholder to milliliter DNA lysis buffer og bruk en homogenis satt til 50 for å homogenisere vevet. Når vevet er fullstendig homogenisert, overføre en milliliter av lysate til en DnAse og RNAse gratis to milliliter mikrocentrifuge rør og isolere DNA i henhold til produsentens protokoll.
Tilsett 500 mikroliter med 100% etanol i isolatet og bland prøven ved inversjon. Etter tre minutter ved romtemperatur, bruk en pipette til å overføre ulllignende DNA-utfelling til et nytt to milliliter DNAse og RNAse gratis rør. La prøven tørke i ett minutt før du legger til en milliliter 75% etanol til røret og inverterer røret tre til seks ganger for å vaske prøven.
Kast etanol etter siste inversjon før du vasker DNA to ganger til med frisk etanol per vask som nettopp vist. Etter siste vask tørker luften prøven i 10 sekunder før dna-et ble oppløst i 52 mikroliter med åtte millimolar natriumhydroksid. Overfør en to mikroliter aliquot av DNA til et spektrofotometer hetteglass og kvantifisere konsentrasjonen av DNA i prøven ved hjelp av et absorbansforhold mellom A260 og 280 i henhold til formelen.
Juster DNA-konsentrasjonen av prøven til 50 nanogram per mikroliter med ytterligere åtte millimolar natriumhydroksid og design primerparet som er spesifikk for den eksogene grønne GFP-sekvensen internt ved hjelp av en åpen kildekode primer design webportal for sanntid PCR-påvisning av GFP-koden og de metastatiske cellene som har invadert og kolonisert de distale stedene til svulsten. Bruk deretter en rask PCR-reagens i sanntid og en PCR-maskin i sanntid som støtter en rask PCR-protokoll i sanntid for kvantitativ PCR-analyse i sanntid av prøven. For påvisning av metastatiske brystkreftceller i lungene, bruk dissekering saks for å åpne brysthulen og skjære forbi hjertet og thymus å utsette luftrøret.
Sett inn en 22 gauge kanyle festet til en 10 milliliter sprøyte som inneholder Bouin-oppløsning i luftrøret og trykk stempelet ned til de kollapsede lungene blir hovne med omtrent to milliliter av oppløsningen. Fjern sprøyten og nålen når lungene er oppblåst og overfør hele lungen til et 15 ml rør som inneholder fersk Bouin-oppløsning. Snu forsiktig røret et par ganger før du forlater vevet for å suge i 24 timer ved romtemperatur.
Neste dag, skyll lungene med vann og legg prøven i et rør på 70% etanol. Bruk deretter et disseksjonsmikroskop for å telle antall metastatiske hvite flekker og knuter på lungenes overflater. Tumorvolummåling av kaliper er en veletablert metode for å vurdere behandlingseffekt.
For å oppnå sammenlignbare signaler mellom studiegrupper må det gjennomføres en pre-imaging BLI kinetikkstudie for å bestemme den beste bildetidsrammen. På grunn av det overlegne signal-til-bakgrunn-forholdet er hele kroppen in vivo BLI ganske følsom for å oppdage metastasesignaler på lavt nivå sammenlignet med GFP-tilnærmingen. Men på grunn av den stabile karakteren til GFP-molekylet, har forskerne tilstrekkelig tid til å behandle før de fanger GFP-signalene fra målorganer i doble reporterstudier.
Dette virkelige eksemplet viser hvordan kaliper tumorstørrelsesmålinger kan forvrenge datatolkningen da denne xenograften mistet det meste av det levedyktige tumorcelleinnholdet samtidig som den opprettholder sin store masse og form. Molekylær deteksjon av sanntid PCR kan også gi overbevisende bevis på hjernemetastase i ortotopisk brystkreft modell ved hjelp av eksogen GFP DNA sekvensering som transfected GFP DNA-sekvensen ikke naturlig eksisterer hos mennesker eller gnagere. Implantasjonsstedet skal være fysiologisk og anatomisk relatert til kreft malignitet.
Både tumorgen og proteinuttrykk kan evalueres på primære og distale steder, og metastatiske celler kan isoleres for videre karakterisering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
