Bioengineering
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Summary March 22nd, 2020
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介绍了一种可靠且易于重现的方法，用于制备可功能的近红外发光金纳米簇，并通过流细胞学和共聚焦激光扫描显微镜直接检测HeLa细胞内部。
Transcript
这是一个简单的协议，用于合成功能化，近红外发射光致发光金纳米集群，并检测其使用商业设置。该技术的主要优点之一是硫醇功能化配体与金纳米聚类表面胺功能配体耦合不会对光致发光特性和线圈稳定性产生不利影响。可以设想，强烈的光致发光特性和与生物分子的结合将允许在体外检测低浓度的硅化物、生物致感、溶解和生物成像。
演示这个程序的将是我的博士生克劳迪娅·克瓦科娃。流动细胞仪将由研究助理阿尔兹贝塔·马格多莱诺娃进行演示。来自伦卡·利布索娃实验室的研究生瓦茨拉夫·博坎将展示这个微观部分。
首先在60微升的二摩尔氢氧化钠中加入7.8毫克的硫酸，加入23.4毫升的超纯水，搅拌混合物，直到完全溶解。接下来在溶液中加入10.2微升四氯化氢，15分钟后，在大力搅拌的同时加入480微升新鲜准备好的波罗氢钠。继续搅拌反应混合物过夜。
第二天，使用三个循环的超滤纯化溶液，分子量切断三千万吨，然后向溶液中加入15.6毫克硫醇终止聚乙二醇，将pH值调整到7至7.5之间，并隔夜搅拌混合物以获得纳米聚二醇。第二天，重复三个循环的离心和过滤，以净化分散。将纳米星团 1 溶液与 TPP 混合，然后用单摩尔氯化氢将 pH 调整为 4.5。
通过添加过量的 EDC HCL 开始反应，并监测混合物的 pH 的第一个小时。如果 pH 增加超过 6，则通过添加氯化氢来减少。在室温下搅拌反应混合物过夜。
第二天，执行三个周期的离心和过滤，如前面所述，以获得纳米群集2。用超纯水稀释 2，体积为 24 毫升。将细胞播种在12井板中，密度为每井2万个细胞。
孵育48小时，然后吸气培养介质，并添加400微升的完整培养介质，或没有500微克的纳米颗粒每井。将细胞返回到37摄氏度的培养箱，进行纳米团内化。两小时后，用标准三辛化分离细胞。
在聚丙烯微离心管和离心机中收集，在350倍的g和4摄氏度下进行5分钟。根据手稿说明准备 FCM 缓冲液，并使用一毫升缓冲液清洗细胞颗粒。将细胞再离心5分钟，然后将它们重新在FCM缓冲液的500微升中，储存在4摄氏度。
在采集样品之前，请确保仪器具有相应的光学配置。将 780 超过 60 波段通道滤波器放在 405A 探测器前面。使用五毫升聚苯乙烯圆底管过滤所有样品，并配有细胞滤株盖。
指定圆度计配置。绘制 FSC-A 和 SSC-A 的双参数点图以显示单元格的分布。要排除双精度，请创建 FSC-H 与 FSC-A 的双参数点图，并绘制荧光通道区域的单参数直方图，以监测样品中的相对荧光强度。
以低流速获取未经处理的样品，以尽量减少重合事件。在采集过程中，调整 PMT 电压，使 FSC 与 SSC 图上未处理的种群保持规模。如有必要，调整 FL 通道的 PMT 电压，将未污染的群体放在直方图的左角。
然后选择软件中的特定门选项卡，并在所需的总体周围绘制适当的门。大门内的单元格将移动到下一个检查点。设置实验并记录数据。
播种后24小时，在每个培养室中加入100微克2，含有0.5毫升的中等和 HeLa 细胞。将培养皿返回到培养箱，让细胞内化纳米团，然后丢弃培养皿，用预谋的新鲜介质清洗细胞。在每个腔室中填充 800 微升的新鲜介质，然后进行成像。
要对细胞进行成像，请使用带计划-APOCHROMAT 和 63 倍油性目标透镜的共合显微镜。将盘子安装在倒置的舞台上，将室内加热到37摄氏度，并配有加湿的5%二氧化碳大气。使用 405 纳米激光器，使用适当的分束器将内部金纳米块设置为 2% 功率，将检测波长范围设置为 650 到 760 纳米之间，以检测内部金纳米星团。
将图像的分辨率设置为 2048 x 2048 像素。在采集速度设置中，目标为像素停留时间约四微秒，以两次平均方式获取图像，然后将针孔设置为一个区域单位，并且为了获得更高的灵敏度，请使用光子计数模式。要使用 DIC 的正确照明和透光，请使用科勒的冷凝器设置和现场停止。
为了获得透射光，请使用 488 纳米激光器，功率为 0.7%，无需分配任何荧光探测器，请确保为激光波长设置适当的分束器。吸收光谱表明，金纳米星团1和2没有典型的表面表面板状带，显示从550到850纳米的宽发射。将TPP附着到1的表面后，光致发光度显著增加。
在365纳米的紫外光下，纳米星团的发射也可见。发射稳定，波长与激发波长无关，但在紫外光激发时强度最大。流细胞学用于确认由 HeLa 细胞吸收的纳米群集 2。
近荧光取决于纳米星团2的孵化时间和浓度。用标准的共声激光扫描显微镜对细胞内的金纳米星团进行无创成像。细胞被染色的纳米星团2，经过24小时的孵育，在细胞内观察到鲜红的光致发光。
在尝试此协议时，重要的是要记住，去除未反应和水解的波罗氢钠非常重要，否则硫化聚乙烯二醇不会与金纳米聚质组的表面结合。此外，金纳米星团的光致发光从560纳米开始。为了避免在共和显微镜实验中的背景自荧光，光子应收集到650纳米以上。
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