माउस ब्रेन के मिनेर्ट के नाभिक बेसलिस में कोलिनेर्गिक फाइबर लंबाई का स्टीरियोलॉजिकल अनुमान

कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में न्यूरोडेनग्रेशन एक पुरानी प्रक्रिया है जिसमें से न्यूरोनल फाइबर हानि अक्सर कोशिका शरीर के नुकसान से पहले होती है। तीन आयामों में न्यूरोनल फाइबर की स्टीरियोलॉजिकल मात्रा प्रारंभिक न्यूरोडीजेनेरेटिव परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और सटीक विधि प्रदान करता है। यह तकनीक 3 डी में न्यूरोनल फाइबर जैसी लाइन जैसी संरचनाओं की लंबाई को मापने के लिए अंतरिक्ष गेंदों के विश्वसनीय और कुशल कंप्यूटर आधारित निष्पक्ष अंश का उपयोग करती है।

प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रभाकर सिंह, एक पोस्ट-डीओसी और स्टीरियोलॉजी में हमारे विशेषज्ञ और मेरी प्रयोगशाला में अनुसंधान सहायक डेविड पेंग द्वारा किया जाएगा । एनेस्थेटाइज्ड माउस में पेडल पलटा के जवाब की कमी की पुष्टि करने के बाद, लगभग 50 मिलीलीटर बर्फ ठंड 0.1 मोलर डीपीबीएस के साथ ट्रांसकार्डेली रूप से व्याप्त है, इसके बाद 0.1 मोलर पीबीएस में 4% पीएफए के लगभग 25 मिलीलीटर हैं। परफ्यूजन के अंत में, चार डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ताजा 4% पीएफए के एक कंटेनर में मस्तिष्क को ठीक करने के बाद।

अगले दिन, प्रति वॉश ताजा डीपीबीएस में तीन से दो मिनट की धोती के साथ मस्तिष्क को धोएं और मस्तिष्क को 0.1 डीपीबीएस समाधान में 15% सुक्रोज में रात भर स्थानांतरित करें। अगली सुबह, मस्तिष्क को 30% सुक्रोज समाधान में रखें और 0.1 मोलर डीपीबीएस को 48 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, मस्तिष्क को क्रायोटोम कक्ष में प्री-सेट को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।

दिमाग को सीलबंद ट्यूबों में रखा जा सकता है और शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सेक्शनिंग के लिए, ऊतक नमूने को इष्टतम काटने के तापमान में एम्बेड करें और नमूना डिस्क पर नमूना माउंट करें। फिर क्रायोटोम में एक कोरोनल विमान में धारावाहिक 30 माइक्रोमीटर मोटी धाराओं का अधिग्रहण, एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में प्रत्येक खंड को स्थानांतरित करना, जिसमें शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस भंडारण की तैयारी में क्रायोप्रोप्रोटेक्तोथ होता है।

प्रत्येक मस्तिष्क के पहले और अंतिम वर्गों की पहचान करने के लिए, एक मानक माउस मस्तिष्क एटलस के साथ रूपात्मक सुविधाओं की तुलना करें। एनबीएम ब्रेग्मा माइनस 0.0 मिलीमीटर से शुरू होता है और शून्य से 1.6 मिलीमीटर पर समाप्त होता है। हर आठवें खंड का चयन कुल छह से सात वर्गों की पैदावार करता है और मात्रा और फाइबर लंबाई अनुमान दोनों के लिए त्रुटि के उचित गुणांक की अनुमति देता है।

ऊतक वर्गों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग के लिए, ट्रिस-बफर खारा में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 में 10% सामान्य गोजातीय सीरम के साथ किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करने के बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों को लेबल करें। इनक्यूबेशन के अंत में, वर्गों को तीन मिनट के लिए ताजा ट्रिस-बफर नमकीन प्रति वॉश में तीन बार धोएं, इसके बाद कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक उपयुक्त बायोटिनाइलेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन करें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रदर्शित ताजा ट्रिस-बफर नमकीन में तीन बार वर्गों को धोएं, इसके बाद निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एविडिन बायोटिन पेरोक्सिडेस कॉम्प्लेक्स और डीएबी पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट समाधान के साथ धुंधला हो गया।

धोने के बाद, एक मस्तिष्क ऊतक नमूने से सभी वर्गों को एक जिलेटिनीकृत स्लाइड पर माउंट करें और नमूनों को सूखने की अनुमति दें। वर्गों को निर्जलित करने के लिए, अनुक्रमिक आरोही इथेनॉल समाधानों में पांच मिनट प्रति कमजोर पड़ने के लिए दो बार नमूनों को विसर्जित करें, जिसके बाद दो 10 मिनट के जाइलीन वॉश के साथ समाशोधन किया जाता है। फिर स्लाइड्स पर कवरस्लिप रखने के लिए एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करें।

स्टीरियोलॉजी के लिए, सॉफ्टवेयर में एक नया अध्ययन खोलें। एक अध्ययन आरंभीकरण संवाद बॉक्स खुलेगा। अध्ययन की जानकारी भरें और पुष्टि करें कि बहु-स्तरीय अंश-आधारित का चयन किया गया है।

वॉल्यूम डायलॉग बॉक्स खोलने के लिए वॉल्यूम पर डबल क्लिक करें। ब्याज की सुविधा का नाम और क्षेत्र बिंदु गिनती जांच का चयन करें और अगले क्लिक करें । लंबाई पर डबल क्लिक करें और सुविधा का एक नाम प्रदान करते हैं।

क्षेत्र की जांच का चयन करें और आगे क्लिक करें । मामले में प्रारंभिक बॉक्स में, अध्ययन शुरू करने से पहले समूहों को कोड करने के लिए, ब्याज के क्षेत्र से ब्याज के क्षेत्र से शुरू होने वाले अनुभागों की कुल संख्या निर्धारित करें जिसमें ब्याज का क्षेत्रफल और अनुभाग नमूना अंतराल आठ तक होता है। जांच आरंभीकरण संवाद बॉक्स खोलने के लिए आगे क्लिक करें जो स्वचालित रूप से क्षेत्र चयन और मात्रा अनुमान के लिए सबसे कम आवर्धन सेट करेगा और सेटिंग्स की पुष्टि करेगा ।

यह जांचने के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें कि चयनित कम आवर्धन पर रुचि के क्षेत्र की पहचान की जा सकती है या नहीं. क्षेत्र की मात्रा अंश और पूर्वावलोकन पर क्लिक करें और किया के लिए प्रति बिंदु 50, 000 माइक्रोमीटर घन दर्ज करें। ऑब्जेक्ट हाई आवर्धन के तहत, लंबाई क्षेत्र संवाद बॉक्स खोलने के लिए लंबाई को 63X और डबल-क्लिक लंबाई में सेट करें।

इस क्षेत्र के व्यास को 10 माइक्रोमीटर पर सेट करें और क्लिक करें। फ्रेम क्षेत्र, फ्रेम ऊंचाई, गार्ड क्षेत्र, और फ्रेम रिक्ति के लिए उचित मूल्य निर्धारित करें। फिर आगे क्लिक करें और सॉफ्टवेयर द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करें।

पहले खंड को डालने के लिए, स्लाइड को 5X उद्देश्य के तहत माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए एनबीएम के चारों ओर एक मनमाने ढंग से सीमा खींचने के लिए हरे तीर पर क्लिक करें। हरे तीर पर क्लिक करें और वर्तमान अंश के फाइबर माप प्राप्त करने के लिए 63X उद्देश्य को बदलने के लिए किया। सेक्शन मोटाई डायलॉग बॉक्स दिखाई देगा।

मैनुअल जेड-एक्सिस फोकस नॉब का उपयोग करके अनुभाग की वास्तविक मोटाई को मापने के लिए अनुभाग की ऊपर और नीचे की सतह सेट करें और किए गए क्लिक करें। आभासी क्षेत्र की जांच की सतह पर सभी एक-दूसरे को काटने वाले फाइबर को चिह्नित करने के लिए अनुभाग की फ्रेम ऊंचाई में जेड-एक्सिस को धीरे-धीरे ऊपर से नीचे तक ले जाएं। जब सभी फाइबर चिह्नित किए गए हों, तो अगले स्थान पर आगे बढ़ने के लिए आगे क्लिक करें।

जब सभी अंश पूरे हो गए हों, तो हरे तीर पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर अगले सेक्शन को डाला है करने के लिए पूछना होगा। 5X उद्देश्य का उपयोग कर ध्यान में स्लाइड पर अगले नमूने लाओ और फाइबर माप दोहराने के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया ।

जब सभी वर्गों को मापा गया है, तो सॉफ्टवेयर त्रुटि मूल्यों के गुणांक को दिखाने वाले मामले के लिए परिणाम उत्पन्न करेगा। यदि त्रुटि का गुणांक स्वीकार्य है, तो अगले मामले में आगे बढ़ें। यदि त्रुटि का गुणांक स्वीकार्य नहीं है, तो सॉफ्टवेयर कुछ मापदंडों को बदलने के लिए सिफारिशें प्रदान करेगा।

जब सभी मामले पूरे हो गए हैं, तो प्रत्येक मामले और समूह के लिए परिणाम उत्पन्न करें। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, स्वीडिश उत्परिवर्ती बीटा एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन समूह ने अपने जंगली प्रकार के कूड़े के साथियों की तुलना में काफी कम फाइबर लंबाई और फाइबर लंबाई घनत्व का प्रदर्शन किया। परिणामों से यह भी पता चला कि विश्लेषण किए गए दोनों समूहों के बीच एनबीएम की मात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था ।

इस तकनीक को सही अभिविन्यास में उचित अधिग्रहण और इनक्यूबेशन अवधि के साथ एक अच्छी धुंधला विधि की आवश्यकता होती है। स्टीरियोलॉजी प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी रैखिक प्रोफाइल जैसे अन्य न्यूरोनल फाइबर, एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं, या यहां तक कि संवहनी प्रोफाइल के अनुमान के लिए किया जा सकता है।