5,889 Views
•
07:40 min
•
October 25, 2019
DOI:
Intracellulære bakterier utskiller effektorproteiner i verten som kan manipulere biologiske veier for å fremme patogenoverlevelse. Avslørende vertsmål for effektorer er avgjørende for å forstå intracellulære patogener som Chlamydia trachomatis. Gjær toksisitet og suppressor skjermer kan gi viktig innsikt om det naturlige biologiske målet for bakteriell effekteller proteiner og kan være spesielt nyttig når en bindende partner er ukjent.
Vi demonstrerer gjær toksisitet og suppressor analyser her for screening for Chlamydia trachomatis effector proteiner, men denne teknikken har også blitt brukt for å karakterisere Legionella pneumophila og Coxiella burnetii effektorer. Begynn med å inokulere fem milliliter av enkelt drop-out kjøttkraft med den eneste kolonien av gjær forvandlet med effektorproteinet som inneholder plasmid. Bruk gjær forvandlet med vektoren alene som en negativ kontroll og inkuber inokulumet over natten ved 30 grader Celsius mens du rister.
Neste dag legger du til 180 mikroliter sterilt vann til A2 gjennom A6-brønnene på en 96-brønnsplate. Vortex over natten kultur og legge til 180 mikroliter gjær til godt A1. Deretter fortynner gjæren i brønnene med vann. Bruk en flerkanals pipette til å oppdage fem mikroliter av hver fortynning på enkelt drop-out glukose og enkelt drop-out galaktose agar plater og inkubere platene på 30 grader Celsius i 48 timer.
Etter inkubasjonen vurderer du visuelt toksisitet ved å sammenligne veksten av gjær som uttrykker effektorproteinet som dyrkes på det galaktoseholdige mediet med veksten av gjær som uttrykker vektoren alene. Inokuler 100 milliliter av enkelt drop-out kjøttkraft med en milliliter av tidligere forberedt gjær lager og inkubere den i 16 til 24 timer ved 30 grader Celsius med risting på 150 RPM. På neste dag legger du til hele 100 milliliter av overnattingskulturen til 900 milliliter forhåndsoppvarmet enkelt drop-out kjøttkraft og inkubere kolben i fire til fem timer ved 30 grader Celsius mens du rister.
Etter inkubasjonen, pellet kulturen på 6000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 250 milliliter sterilt vann. Gjenta sentrifugeringen og kast overnatanten.
Deretter gjenbruker pellet i 250 milliliter av en millimolar litiumacetat. Pellet kulturen ved sentrifugering, fjern litiumacetat, og resuspend pellet i 9,6 milliliter på 50% PEG 3350. Tilsett deretter transformasjonsreagenser som beskrevet i manuskriptet og juster volumet til 15 milliliter med sterilt vann invertert forsiktig for å blande.
Inkuber blandingen ved 30 grader Celsius i 30 minutter. Tilsett deretter 750 mikroliter DMSO og inkubere i et vannbad ved 42 grader Celsius i ytterligere 30 minutter. Å legge til DMSO før varmesjokk er avgjørende for å oppnå en høy transformasjonseffektivitet.
Etter inkubasjonen pellet gjæren ved sentrifuging på 3000 ganger g i fem minutter. Kast supernatanten og vask pelleten med 10 milliliter sterilt vann og gjenta sentrifugeringen for å pellet gjæren. Resuspend pellet i åtte milliliter vann.
Bestem transformasjonseffektiviteten ved å fortynne prøven en til 10 og plating 100 mikroliter av hver fortynning på dobbel drop-out agar. Deretter plate 200 mikroliter av prøven på dobbel drop-out galaktose agar plater og inkubere platene på 30 grader Celsius i 48 til 96 timer eller til kolonier vises. Når kolonier har dukket opp, dem på dobbel drop-out galaktose agar og inkubere dem i ytterligere 24 til 48 timer.
Bruk en del av plasteret til å inokulere fem milliliter dobbel drop-out kjøttkraft og inkubere inoculum over natten ved 26 grader Celsius med risting ved 150 RPM. På neste dag, tilsett 180 mikroliter sterilt vann til fem brønner av en 96-brønns plate som starter med godt A2. Vortex kulturmiksen over natten. Tilsett 180 mikroliter gjær til brønn A1 og fortynne det serielt ved hjelp av vannet i brønner A2 til A6. Spot fem mikroliter av hver fortynning på enkelt drop-out glukose og enkelt drop-out galaktose agar plater sørge for å inkludere giftig effektor alene som en kontroll.
Inkuber platene ved 30 grader Celsius i 48 timer og sammenlign deretter veksten av gjæren med giftig effektor alene med veksten av gjær med den potensielle suppressoren. For å bekrefte suppressors som har vist redusert toksisitet sammenlignet med giftig effektor alene, isolere plasmid i henhold til manuskriptretninger og re-forvandle den til giftig gjær. Inokuler dobbel drop-out glukosebuljong med en koloni fra transformasjonsplaten.
Inkuber den over natten og se på dobbel drop-out glukose og galaktose agar for å bekrefte undertrykkelse av toksisitet. Før gjærsuppressorskjermen ble effektorproteinene av interesse testet for toksisitet i gjær. Proteinet av interesse ble uttrykt i gjær under kontroll av en galaktose induserbar promotor og vekst på galaktose ble sammenlignet med vekst på glukose.
Når CT229 ble testet for toksisitet, ble mindre kolonier og vekstundertrykkelse observert. Ideelt sett bør en to til tre loggreduksjon observeres for å fortsette med gjærsuppressorskjermer. Suppressor skjermen ble utført ved å forvandle giftig belastning med gjær genomisk bibliotek pYAP 13 og plating transformantene på galaktose agar.
De oppnådde suppressor kloner ble oppdaget på dobbel drop-out galaktose agar for å bekrefte undertrykkelse av toksisitet. Suppressors pSup1 og pSup2 undertrykte toksisiteten av effektorproteinet, mens pSup3 ikke gjorde det. Disse prosedyrene krever nøye oppmerksomhet på detaljer i tillegg til kritisk forberedende arbeid, inkludert å ha store mengder medier og plater klare før du utfører eksperimentet.
Når suppressors er identifisert, eksperimenter kan utføres for å verifisere interaksjoner med effekten av interesse inkludert pull downs, immunofluorescence colocalization, effector knockout eller knockdown av vertsfaktorer identifisert i skjermene. Utvikling av denne teknikken for Klamydia effektorer har tillatt for fremskyndet foreløpig karakterisering av effektor proteiner og bidratt til å fokusere vår innsats på å belyse de underliggende molekylære mekanismer som megle vert patogen interaksjoner.
Bakterielle patogener skiller proteiner inn i verten som mål avgjørende biologiske prosesser. Identifisering av verts banene som er målrettet mot bakterielle effektor proteiner, er nøkkelen til å ta opp molekylær patogenesen. Her er en metode som bruker en modifisert gjær Suppressor og toksisitet skjermen for å belyse vert trasé målrettet av giftige bakteriell effektor proteiner er beskrevet.
Read Article
Cite this Article
Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).
Copy