6,430 Views
•
09:43 min
•
April 11, 2020
DOI:
Samspillet mellem proteiner og peptider med uorganisk materiale er et grundlæggende fænomen med konsekvenser for nanoteknologi, biomaterialer og bioteknologi. Det første skridt i at forstå et sådant fænomen er at afsløre de grundlæggende fysisk-kemiske konstanter såsom adsorption konstant, Gibbs fri energi, enthalpy, entropi, og begrænset adsorption, som kan evalueres ved at etablere adsorption isotherms. Adsorption fra væskefasen er dog begrænset med kinetik, overfladekapacitet, pH og sammenlignende adsorption, som alle bør overvejes bevidst, før forsøget sættes.
I denne video vil mine kolleger Elena Korina og Sergei Neifert præsentere den fysisk-kemiske undersøgelse af dipeptid adsorption på opløsning sprede titandioxid, der dækker forberedelsesfunktioner, der vil hjælpe med at undgå skjulte risici, som forskere kan stå over for, mens de udfører relevante eksperimenter. 183 mg dipeptid anbringes i det sterile polymere reagensglas og fortyndes op til ca. 35 milliliter med dobbelt destilleret vand og opløses ved stuetemperatur under kraftig omrøring. Hvis dipeptid ikke opløses i dobbelt destilleret vand og omrøring, skal du placere dipeptidopløsningen i ultralydsbadet og sonikere i et par minutter.
PH for forsløset opløsning af et peptid justeres til 7,4 ved forsigtigt at tilsætte mes- eller natriumhydroxidopløsningen til dipeptidopløsningen ved omrøring ved stuetemperatur og overvåge pH-chloren med en pH-måler. Efter justering af pH hældes opløsningen i målecylinder. Reagensglasset skylles og måles cylinderen fyldes med det dobbelte destilleret vand op til 40 milliliter for at gøre den endelige koncentration på 16 millimolar.
Der forbereds dipeptidfortyndinger med koncentrationer mellem 0,4 og 12 millimolar ved at fortynde 16 millimolar dipeptidopløsning med dobbelt destilleret vand. For eksempel, for at forberede otte millimolar dipeptid opløsning, tilsættes syv milliliter dobbelt destilleret vand til 10 milliliter 16 millimolar dipeptid opløsning. Efter fortynding justeres pH-chlor. til 7,4 ved at tilsætte dråbevis opløsning af MES eller natriumhydroxid til dipeptidopløsningen.
Efter justering af pH hældes opløsningen i målecylinderen. Reagensglasset skylles og måles cylinderen fyldes op til 20 milliliter med dobbelt destilleret vand for at lave en koncentration på otte millimolar. Andre fortyndinger af dipeptid stamopløsning fremstilles i overensstemmelse hermed.
I sidste ende får vi en række dipeptidfortyndinger klar til adsorption undersøgelser. Forbered 10 millimolar MES buffer løsning. PH-chlor. 1.4 justeres med trinatiumhydroxid ved omrøring og overvågning af pH-chlor.
Denne opløsning vil blive brugt til den eneste forberedelse. Grind ca 200 milligram nanokrystallinsk titaniumoxid i en morter i mindst fem minutter. Vejer 40 milligram grind titandioxid nanopartikler.
Kolben anbringes i sonikeringsbadet ved hjælp af laboratoriestanderen. Grind titandioxid i 20 milliliter MES buffer i kolben ved hjælp af glastragt og sonikere i et ultralydbad i 20 minutter. Indstil termostaten til den ønskede temperatur.
Der tilsættes en milliliter sonikeret tunge titandioxid til de markerede adsorptionshætteglas. De markerede adsorptionshætteglasser skal ske mod tilsvarende fortyndinger i en improviseret flydende anordning af styrofoam, og den sættes ind i termostaten for at kvilibrere temperaturen i mindst fem minutter. Derefter tilsættes en milliliter dipeptidfortynding til det tilsvarende markerede adsorptionshætteglas, og der sikres, at alle blandingsopløsninger har samme temperatur.
Hold rækken af opnåede adsorptionsprøver på termostaten i 24 timer for at opnå adsorptionsligevægten. Lejlighedsvis ophidse titaniumoxid dispersioner under termostatning. For at undgå temperaturinduceret omvægtning udtages der en prøve fra termostaten til filtrering ad gangen.
Tag en prøve af dipeptidopløsningen fra hvert glasglas med en sprøjte. Fjern kanylen fra sprøjten, og tag sprøjtefilteret på for at filtrere dipeptidopløsningen ind i glashætteglasset. Filtreringen gentages med prøver af andre koncentrationer.
Nu er disse prøver klar til analyse. Gør 50 milliliter opløsningen af TFA i acetonitrile. Spike 0,34 milliliter TFA i målecylinderen og juster opløsningens volumen til 50 milliliter med acetonitril ved stuetemperatur.
Forbered derivatiseringsløsningen. Spike 299 mikroliter af fænoylisothiocyanat og 347 mikroliter triethylamin i målecylinderen og fyld cylinderen op til 50 milliliter med acetononile. Før den højtydende væskekromatografianalyse derivatize prøverne med Edmans reagenser i kromatografiglas.
Prøvens 400 mikroliter blandes med 400 mikroliter af derivatiseringsgenser. Hold prøverne på 60 grader i 15 minutter. Efter opvarmning neutraliseres prøverne med 225 mikroliter TFA-opløsning, og vent i et par minutter for at afkøle prøven til stuetemperatur.
Brug HPLC-analyse til at bestemme koncentrationen af dipeptidopløsningen før og efter adsorptionen. Start analysen af prøverne med de nødvendige betingelser, som er fastsat af softwaren. Adsorptionsafhængigheden fra ligevægtsdipeptidkoncentrationen efter adsorption, adsorptionsisotermer blev afbildet i overensstemmelse hermed i forhold til de opnåede forsøgsdata.
Målingerne af dipeptid adsorption blev data behandlet ved hjælp af Henry-modellen. Ligevægtsbindingskonstanten blev opnået fra hældningen af dipeptid adsorptionens afhængighed af dipeptidsligevægtkoncentrationen. Van’t Hoff ligningen blev brugt til at bestemme standard Gibbs fri energi for hver temperatur.
Plot i en graf over fri energi versus temperatur, vi bestemmes enthalpy som aflytning af den lineære graf med en fri energi akse for dipeptid. Ændringen i entropi for hver temperatur blev bestemt ud fra den grundlæggende ligning. De beregnede værdier af ligevægtsbindingskonstant, standard Gibbs fri energi, enthalpi og entropi for dipeptid præsenteres i tabel et.
Adsorption isotherm konstruktion fra udtynding data er fortsat at være den mest tilgængelige metode, der ikke kræver dyre opsætninger, der giver udtømmende fysisk-kemiske data for bogstaveligt talt hver opløselige sorbat. Kombineret med spektroskopiske eller computerbaserede data, det kan afsløre grundlæggende strukturelle træk ved komplekse adfærd biomolekyler ved at kontakte de uorganiske nanopartikler.
Det første skridt i at forstå biomolekyle-uorganisk fast fase interaktion afslører grundlæggende fysisk-kemiske konstanter, der kan evalueres ved at etablere adsorption isotermer. Adsorption fra væskefasen begrænses af kinetik, overfladekapacitet, pH og konkurrencedygtig adsorption, som alle bør overvejes med forsigtighed, før der angives et adsorptionseksperiment.
Read Article
Cite this Article
Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).
Copy