Biology
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Identification de nouveaux régulateurs de la transpiration végétale par le dépistage thermique à grande échelle à Helianthus Annuus
Chapters
Summary January 30th, 2020
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Nous fournissons une méthode pour identifier les modulateurs de la transpiration foliaire par le criblage à grande échelle d'une bibliothèque composée.
Transcript
Ce protocole utilise l’imagerie thermique pour identifier de nouveaux composés capables de réguler la transpiration des plantes. Cette technique est polyvalente en ce qui concerne les espèces végétales qui peuvent être testées, la nature du composé et le type d’imagerie. Pour mettre en place les plantes pour la culture, ajoutez d’abord une couche de quatre centimètres d’épaisseur de vermiculite fine aux plateaux végétaux standard de 10 x 20 pouces sans trous et placez les porte-graines à deux centimètres l’un de l’autre dans les plateaux.
Remplissez les porte-graines de vermiculite et placez une graine de tournesol pointue vers le bas dans chaque support afin que la moitié de la graine reste exposée. Lorsque toutes les graines ont été plaquées, recouvrez-les de deux centimètres supplémentaires de vermiculite fine et vaporiser d’eau d’en haut. Après une heure, couvrir les plateaux de couvercles et placer les plantes dans une chambre de croissance dans une serre.
Pour mettre en place le système hydroponique, remplissez un récipient de taille appropriée adapté à la culture hydroponique des plantes avec de l’eau distillée et ajoutez l’engrais hydroponique général comme indiqué par le fabricant. Utilisez ensuite des pompes à air et à eau pour aérer la solution hydroponique qui en résulte avec un mouvement constant. Pour préparer les flotteurs hydroponiques, couper une feuille de mousse de polystyrène élargie de deux centimètres d’épaisseur aux dimensions du récipient et utiliser un outil de combustion du bois pour faire des trous d’un à deux centimètres de diamètre dans la mousse.
Placez ensuite les flotteurs dans le système hydroponique. Cinq jours après la plantation, retirer délicatement les semis de la vermiculite. Placer immédiatement les semis dans un récipient d’eau pendant 30 minutes pour enlever l’excès de vermiculite et ramollir les péricarpes restants.
Lorsque les racines primaires émergentes sont visibles, enlever les péricarpes à la main au besoin. Transférer les semis à l’intérieur des porte-graines dans les flotteurs préparés en mousse de polystyrène dans le système hydroponique. Faire pousser les plantes en culture hydroponique pendant deux jours.
Laissez les produits chimiques de la petite bibliothèque composée décongeler à température ambiante. Étiquetez six microtubes sans bouchon de deux millilitres pour le traitement de contrôle négatif, trois tubes pour le traitement ABA, et les 60 derniers tubes pour l’analyse des effets des 20 produits chimiques d’intérêt pour le triplicate. Ajouter 10 microlitres de chaque produit chimique dans chacun des tubes à essai, 10 microlitres de 10 millimilliards d’ABA et de sulfure de diméthyle dans les trois tubes ABA, et 10 microlitres de sulfure de diméthyle dans les six tubes de commande.
Mélangez ensuite soigneusement 990 microlitres d’hydroxyde de potassium MES de 10 millimilliles dans chaque tube. Placez les tubes dans une grille à tubes avec le contrôle positif et négatif et les tubes expérimentaux répartis uniformément dans le rack pour tenir compte du biais lié à la position. Pour configurer la caméra thermique, montez d’abord la caméra sur un support de copie et connectez tous les câbles à un ordinateur portable.
Allumez la caméra avant d’allumer l’ordinateur portable et d’ouvrir le logiciel d’analyse d’imagerie thermique. Pour ajuster les paramètres d’enregistrement, roulez la souris sur le bouton Enregistrer pour permettre la sélection de l’icône clé sous Paramètres d’enregistrement et sélectionnez le mode d’enregistrement et les options appropriés. Pour le traitement des semis, soulevez soigneusement le porte-graines et trempez rapidement la racine dans le plat peu profond contenant de l’eau.
Couper la racine primaire de chaque semis sous l’eau de 0,8 à un centimètre sous l’extrémité la plus basale du porte-graines pour prévenir la capitation et insérer la plante fraîchement coupée dans un tube de produits chimiques. Lorsque tous les semis ont été transférés, placez les plantes sous la caméra thermique et confirmez que toutes les plantes sont dans le champ de vision de la caméra. Pour concentrer la caméra sur la surface des cotylédons, appuyez sur Contrôle Alt A et cliquez sur Enregistrer un film.
Une nouvelle fenêtre confirmant l’enregistrement s’ouvrira. Après une à deux heures, arrêtez l’enregistrement. Pour l’analyse des données, ouvrez les fichiers seq corrects et mettez le film en pause.
Cliquez sur l’ajouter une région curseur de mesure d’intérêt trois par trois pixels icône et déplacer la souris sur le centre d’un cotyledon de la première plante. Cliquez à gauche sur l’image pour étiqueter le cotyledon. Étiquetez le deuxième cotyledon de la première plante de la même manière.
Lorsque toutes les plantes ont été étiquetées avec deux curseurs, cliquez sur les régions d’édition de l’icône d’intérêt et cliquez à gauche tenir et faire défiler pour sélectionner toutes les régions d’intérêt. Ensuite, roulez la souris sur l’icône de visionneuse statistique et sélectionnez l’intrigue temporelle. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
Exécutez le film, un graphique se remplira avec les données. Ensuite, dans la fenêtre graphique, cliquez sur la double flèche pour ouvrir un nouveau menu et cliquez sur l’icône enregistrer pour enregistrer les données. L’utilisation de l’érythrosine B de colorant rouge démontre la capacité des produits chimiques à être visiblement absorbés par une racine coupée dans les cotyléons d’un semis de tournesol dans les 10 minutes.
Lorsque les plantes sont traitées avec aba, une augmentation de la température des feuilles est détectée chez les cotylédons de tournesol dans les 30 minutes qui est associée à la diminution de l’ouverture stomatale et la conductance stomatale. En outre, une température foliaire accrue est observée 15 minutes après le traitement avec 10 micromolaires ABA et 20 minutes après le traitement avec cinq micromolaires ABA démontrant que la mesure de la température des feuilles par imagerie thermique est un bon indicateur pour mesurer l’ouverture stomatale et la conductance. Dans cette expérience représentative, un traitement statistique standard basé sur le score permet l’identification de produits chimiques qui favorisent la fermeture ou l’ouverture stomatale.
Pour mesurer les effets des composés sur la transpiration, il est important de cultiver des plantes dans des conditions optimales de lumière, d’humidité et de température. Ce protocole peut être appliqué à la plupart des dicots. Il peut également être utilisé pour évaluer l’effet de nouveaux composés sur la performance photosynthétique, par exemple en mesurant la fluorescence chlorophylle.
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