Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i Helianthus Annuus

Detta protokoll använder termisk avbildning för att identifiera nya föreningar kunna reglera växt transpiration. Denna teknik är mångsidig när det gäller de växtarter som kan testas, arten av föreningen, och vilken typ av bildbehandling. För att ställa in växterna för odling, först lägga till en fyra centimeter tjockt lager av fin vermikulit till standard 10 av 20 tums växt brickor utan hål och placera fröhållare två centimeter isär i facken.

Fyll fröinnehavarna med vermikulit och placera en solrosfrö spetsig ände ner i varje hållare så att hälften av fröet förblir exponerat. När alla frön har pläterat, täck dem med ytterligare två centimeter fin vermikulit och dimma med vatten från ovan. Efter en timme, täck brickorna med lock och placera växterna i en tillväxtkammare i ett växthus.

För att ställa in hydroponics systemet, fylla en lämpligt storlek behållare lämplig för odling av växter hydroponically med destillerat vatten och lägga till allmänna hydroponics gödningsmedel som anges av tillverkaren. Använd sedan luft- och vattenpumpar för att lufta den resulterande hydroponicslösningen med konstant rörelse. För att förbereda hydroponics floaters, skär ett ark av två centimeter tjock expanderat polystyren skum till dimensionerna av behållaren och använda vedeldning verktyg för att göra en till två centimeter diameter hål i skummet.

Placera sedan floaters i hydroponics systemet. Fem dagar efter plantering, försiktigt dra plantorna ur vermikulit. Placera omedelbart plantorna i en behållare med vatten i 30 minuter för att avlägsna överskottsvermikulit och för att mjuka upp de återstående pericarpsna.

När de framväxande primära rötterna är synliga, ta bort pericarpsna för hand vid behov. Överför plantorna inom fröhållarna till de beredda polystyrenskumflötarna i hydroponicssystemet. Odla växterna i hydroponics i två dagar.

Låt kemikalierna från det lilla föreningsbiblioteket tina i rumstemperatur. Märk sex kapfria två milliliter mikrorör för den negativa kontrollbehandlingen, tre rör för ABA-behandlingen, och de sista 60 rören för analys av effekterna av de 20 kemikalierna av intresse för tre exemplar. Tillsätt 10 mikroliter av varje kemikalie i vart och ett av provrören, 10 mikroliter på 10 millimolar ABA och dimetylsulfoxid i de tre ABA-rören och 10 mikroliter dimetylsulfoxid i de sex kontrollrören.

Blanda sedan försiktigt 990 mikroliter på 10 millimolar MES kaliumhydroxid i varje rör. Placera rören i ett rör rack med den positiva och negativa kontroll och experimentella rör jämnt fördelade inom racket för att ta hänsyn till position relaterade bias. För att ställa in värmekameran monterar du först kameran på ett kopieringsställ och ansluter alla kablarna till en bärbar dator.

Slå på kameran innan du slår på den bärbara datorn och öppna programvaran för analys av värmebilder. Om du vill justera inspelningsparametrarna rullar du musen över knappen Spela in för att tillåta val av skiftnyckelikonen under Inspelningsinställningar och väljer lämpligt inspelningsläge och alternativ. För behandling av plantorna, lyft försiktigt fröhållaren och doppa snabbt roten i den grunda skålen som innehåller vatten.

Skär den primära roten av varje planta under vatten 0,8 till en centimeter under den mest basala änden av fröhållaren för att förhindra capitation och sätt in den nyklippta anläggningen i ett rör av kemikalier. När alla plantor har överförts, placera växterna under värmekamera och bekräfta att alla växter är inom synfältet för kameran. Om du vill fokusera kameran på cotyledons yta trycker du på Kontroll Alt A och klickar på Spela in en film.

Ett nytt fönster som bekräftar inspelningen öppnas. Efter en till två timmar, stoppa inspelningen. För dataanalys öppnar du rätt seq-filer och pausar filmen.

Klicka på ikonen lägg till en måttmarkörregion av intresse tre gånger tre pixlar och flytta musen över mitten av en cotyledon av den första anläggningen. Vänsterklicka på bilden för att märka cotyledon. Märk den andra cotyledon av den första anläggningen på samma sätt.

När alla växter har märkts med två markörer klickar du på ikonen redigera områden av intresse och vänsterklicka håll och bläddra för att välja alla de regioner av intresse. Därefter rulla musen över ikonen statistikvisning och välj temporala tomt. Ett nytt fönster öppnas.

Kör filmen, kommer en graf fylla med data. Klicka sedan på dubbelpilen i graffönstret för att öppna en ny meny och klicka på sparikonen för att spara data. Användningen av det röda färgämnet erythrosin B visar kemikaliernas förmåga att synligt absorberas genom en skuren rot i cotyledonerna på en solrosplanta inom 10 minuter.

När växter behandlas med ABA, en ökning av bladtemperaturen detekteras i solros cotyledons inom 30 minuter som är associerad med minskningen i stomatal bländare och den stomatal kondutans. Dessutom observeras en ökad foliartemperatur 15 minuter efter behandling med 10 mikromolar ABA och 20 minuter efter behandling med fem mikromolar ABA som visar att mätningen av bladtemperaturen genom termisk avbildning är en bra proxy för mätning av stomatal bländare och kondutans. I detta representativa experiment, en standard score-baserad statistisk behandling tillåta identifiering av kemikalier som främjar stomatal stängning eller öppning.

För att mäta effekterna av föreningar på transpiration, Det är viktigt att odla växter under optimala förhållanden av ljus, luftfuktighet, och temperatur. Detta protokoll kan tillämpas på de flesta dicots. Det kan också användas för att utvärdera effekten av nya föreningar på fotosyntetiska prestanda, till exempel genom att mäta klorofyll fluorescens.