Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Dieses Protokoll verwendet Wärmebildgebung, um neue Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Pflanzentranspiration zu regulieren. Diese Technik ist vielseitig in Bezug auf die Pflanzenarten, die getestet werden können, die Art der Verbindung, und die Art der Bildgebung. Um die Pflanzen für den Anbau aufzustellen, fügen Sie zunächst eine vier Zentimeter dicke Schicht feinen Vermiculits zu Standard 10 mal 20 Zoll Pflanzenschalen ohne Löcher hinzu und legen Sie Die Samenhalter zwei Zentimeter voneinander entfernt in die Schalen.

Füllen Sie die Samenhalter mit Vermiculit und legen Sie ein Sonnenblumenkernspitzein dein Ende in jeden Halter, so dass die Hälfte des Samens freigelegt bleibt. Wenn alle Samen plattiert sind, bedecken Sie sie mit weiteren zwei Zentimeterfeiner Vermiculit und Nebel mit Wasser von oben. Nach einer Stunde die Schalen mit Deckeln bedecken und die Pflanzen in einer Wachstumskammer in einem Gewächshaus platzieren.

Um das Hydroponiksystem einzurichten, füllen Sie einen entsprechend großen Behälter, der für den Anbau von Pflanzen hydroponisch mit destilliertem Wasser geeignet ist, und fügen Sie den vom Hersteller angegebenen allgemeinen Hydroponikdünger hinzu. Verwenden Sie dann Luft- und Wasserpumpen, um die resultierende Hydroponiklösung mit konstanter Bewegung zu belüften. Um die Hydroponik Schwimmer vorzubereiten, schneiden Sie ein Blatt von zwei Zentimeter dicke expandiertem Polystyrolschaum auf die Abmessungen des Behälters und verwenden Holzverbrennungswerkzeug, um Ein bis zwei Zentimeter Durchmesser Löcher im Schaum zu machen.

Dann legen Sie die Schwimmer in das Hydroponiksystem. Fünf Tage nach der Pflanzung die Sämlinge vorsichtig aus dem Vermiculit ziehen. Die Sämlinge sofort 30 Minuten lang in einen Behälter mit Wasser geben, um überschüssigevermiculit zu entfernen und die restlichen Perikarpfen zu erweichen.

Wenn die entstehenden Primärwurzeln sichtbar sind, entfernen Sie die Perikarpfen bei Bedarf von Hand. Die Sämlinge innerhalb der Samenhalter in die vorbereiteten Polystyrolschaumschwimmer im Hydroponiksystem geben. Wachsen Sie die Pflanzen in Hydroponik für zwei Tage.

Lassen Sie die Chemikalien aus der kleinen Verbundbibliothek bei Raumtemperatur auftauen. Etikettieren Sie sechs kaplose Zwei-Milliliter-Mikroröhren für die Negativkontrollbehandlung, drei Röhren für die ABA-Behandlung und die abschließenden 60 Tuben zur Analyse der Auswirkungen der 20 Chemikalien, die für Triplicate von Interesse sind. Fügen Sie 10 Mikroliter jeder Chemikalie in jedes der Reagenzgläser, 10 Mikroliter 10 Millimolar ABA und Dimethylsulfoxid in die drei ABA-Röhren und 10 Mikroliter Dimethylsulfoxid in die sechs Kontrollröhrchen.

Dann 990 Mikroliter 10 Millimolar MES Kaliumhydroxid sorgfältig in jede Röhre mischen. Legen Sie die Rohre in ein Rohrgestell mit der positiven und negativen Kontrolle und Experimentelle Norden gleichmäßig innerhalb des Racks verteilt, um positionbezogene Verzerrung zu berücksichtigen. Um die Wärmebildkamera einzurichten, montieren Sie die Kamera zuerst an einem Kopierständer und schließen Sie alle Kabel an einen Laptop an.

Schalten Sie die Kamera ein, bevor Sie den Laptop einschalten, und öffnen Sie die Wärmebildanalysesoftware. Um die Aufnahmeparameter anzupassen, rollen Sie mit der Maus über die Aufnahmetaste, um die Auswahl des Schraubenschlüsselsymbols unter Aufnahmeeinstellungen zu ermöglichen, und wählen Sie den entsprechenden Aufnahmemodus und die entsprechenden Optionen aus. Für die Behandlung der Sämlinge den Samenhalter vorsichtig anheben und die Wurzel schnell in die flache, wasserhaltige Schale tauchen.

Schneiden Sie die Primärwurzel jedes Sämlings unter Wasser 0,8 bis 1 Zentimeter unter dem basalsten Ende des Saatguthalters, um eine Versenkung zu verhindern, und legen Sie die frisch geschnittene Pflanze in eine Röhre mit Chemikalien ein. Wenn alle Sämlinge übertragen wurden, stellen Sie die Pflanzen unter die Wärmebildkamera und bestätigen Sie, dass sich alle Pflanzen im Sichtfeld der Kamera befinden. Um die Kamera auf die Oberfläche der Cotyledons zu fokussieren, drücken Sie Control Alt A und klicken Sie auf Film aufnehmen.

Ein neues Fenster, das die Aufzeichnung bestätigt, wird geöffnet. Beenden Sie nach ein bis zwei Stunden die Aufnahme. Öffnen Sie für die Datenanalyse die richtigen seq-Dateien, und halten Sie den Film an.

Klicken Sie auf den Messcursorbereich von Interesse drei mal drei Pixel und bewegen Sie die Maus über die Mitte eines Cotyledons der ersten Pflanze. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Bild, um das Cotyledon zu beschriften. Etikettieren Sie das zweite Cotyledon der ersten Pflanze auf die gleiche Weise.

Wenn alle Pflanzen mit zwei Cursorn beschriftet wurden, klicken Sie auf das Symbol “Segmente von Interesse bearbeiten”, und klicken Sie mit der linken Maustaste auf “Halten” und scrollen Sie, um alle Interessenbereiche auszuwählen. Rollen Sie als Nächstes mit der Maus über das Statistik-Viewer-Symbol, und wählen Sie das zeitliche Diagramm aus. Ein neues Fenster wird geöffnet.

Führen Sie den Film aus, wird ein Diagramm mit den Daten gefüllt. Klicken Sie dann im Diagrammfenster auf den Doppelpfeil, um ein neues Menü zu öffnen, und klicken Sie auf das Symbol speichern, um die Daten zu speichern. Die Verwendung des roten Farbstoffs Erythrosin B zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, innerhalb von 10 Minuten durch eine geschnittene Wurzel sichtbar in die Cotyledons eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden.

Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb von 30 Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cotyledons festgestellt, der mit der Abnahme der stomataalen Blende und der stomatalen Leitfähigkeit verbunden ist. Darüber hinaus wird eine erhöhte Blatttemperatur 15 Minuten nach der Behandlung mit 10 Mikromolaren ABA und 20 Minuten nach der Behandlung mit fünf mikromolaren ABA beobachtet, die zeigen, dass die Messung der Blatttemperatur durch Wärmebildgebung ein guter Proxy für die Messung der stomataalen Blende und Leitfähigkeit ist. In diesem repräsentativen Experiment ermöglicht eine standardscorebasierte statistische Behandlung die Identifizierung von Chemikalien, die das stomatoale Schließen oder Öffnen fördern.

Um die Auswirkungen von Verbindungen auf die Transpiration zu messen, ist es wichtig, Pflanzen unter optimalen Bedingungen von Licht, Feuchtigkeit und Temperatur zu züchten. Dieses Protokoll kann auf die meisten Dicots angewendet werden. Es kann auch verwendet werden, um die Wirkung neuer Verbindungen auf die photosynthetische Leistung zu bewerten, z. B. durch Messung der Chlorophyllfluoreszenz.