Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
为梭状体开发拉瓦尔斑马鱼感染模型
Chapters
Summary February 14th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
这里介绍的是一种安全有效的方法，通过微注射和非侵入性微藻感染斑马鱼幼虫荧光标记厌氧C.困难。
Transcript
这种方法可以回答有关先天免疫系统在梭菌感染中的作用的关键问题，如巨噬细胞是否和如何识别或吞噬这种病原体。这种方法的主要优点是，它可以应用于许多不同的厌氧细菌，感染时间可以操纵，口服给药代表正常的人类感染更近。培养后，将培养的一毫升转移到分光光度计的库维特中，并测量OD600。
将所需量转移到新鲜 1.5 毫升管中，以便在最终体积的一毫升内达到 1 到 1.2 的最终 OD。用1X PBS的1毫升清洗一次，在室温下以5000次g离心，3分钟。在 1X PBS 的一毫升中重新发送。
将准备好的荧光染料的工作溶液的三微升加入一毫升细菌悬浮液中。在黑暗中室温下孵育样品15分钟。之后，用1X PBS清洗染色的梭三二胺困难一次，去除残留染料，并在1X PBS的一毫升中重新暂停，实现OD600的1.0。
首先，将0.8%的低熔化阿加罗斯滴到宠物菜中的斑马鱼幼虫上盖上。轻轻地将幼虫调整到横向位置。将培养皿放在冰上30至60秒，使低熔化的红糖凝固。
加入30%达尼欧的介质，含有0.02%至0.04%三分之一，以覆盖红糖。要准备注射溶液，在PBS溶液中加入0.5%酚红色微升，加入染色的梭三二胺困难二恶英的9微升中。使用微加载器使用喷射溶液加载校准的微注射针。
将加载的针头安装到微操纵器中，并在立体显微镜下放置。调整 600 到 900 个下顶卡之间的喷射压力。将喷射时间设置为 0.1 至 0.3 秒，以获得 0.5 至 1.0 纳米光。
将微操纵器中的针头设置为大约 45 度角，指向嵌入的幼虫。将针尖放在胃肠道上方，靠近泌尿生殖孔。穿过阿加罗斯，然后用针尖刺穿肌肉。
然后将其插入肠道流明，并注射0.5至1.0纳米光的梭三二胺困难。使用荧光显微镜监测注射的幼虫，并使用灵活的微加载器尖端拾取正确注射的幼虫进行共合成像。在带凹槽的1.5%的加糖板块中，将0.8%的低熔加糖滴到斑马鱼幼虫上覆盖。
轻轻调整幼虫，头部朝直，在凹槽中以 45 度角朝头，尾部靠槽壁。轻轻操作针头通过阿加罗斯，然后进入斑马鱼幼虫的嘴里，通过食道。一旦针头的尖端位于前肠道球内，按下注射踏板，释放0.5至1纳米细菌培养。
填充肠道的流明。不要让它溢出食道或氯卡。轻轻地从斑马鱼的嘴里取针。
在加夫格之后，用灵活的微装载机尖端从阿加罗斯中救出受感染的斑马鱼幼虫，先将幼虫切开，然后抬起幼虫。这些幼虫转移到无菌的30%达尼欧的培养，并冲洗两次。麻醉斑马鱼幼虫后，加入200至300微升1%的低熔化阿加罗斯，以覆盖麻醉幼虫。
将幼虫的感染区域尽可能放在玻璃滑梯上。让加糖在冰上凝固30至60秒。将阿加罗斯淹没在含有0.02%至0.04%三分之三的介质中。
继续用共和激光扫描显微镜对幼虫进行成像。对受感染的斑马鱼幼虫进行安乐死后，将针头插入靠近斑马鱼幼虫头部的后躯干，使斑马鱼固定。用长矛把刺后面的头部去掉。
将第二根针插入后躯干中间。将第三根针插入斑马鱼的腹部，将肠子从体腔中拉出。使用微注射针将 10 至 15 肠道转移到含有 200 微升无菌 1X PBS 的 1.5 毫升管中。
用害虫使肠道均质化，以扰乱组织并准备同质化。确保害虫到达管子底部，完全破坏所有肠道。加入同质，加入含有D-环素和西福克斯西丁的梭三二恶英困难养殖介质，带或不带陶罗胆碱，并在厌氧室中孵育。
在这项研究中，嗜中性粒细胞和巨噬细胞都到达感染点。激活巨噬细胞噬菌体化两种细菌的例子显示了通过吞噬和消化标记的梭三二胺困难清除。在受精后五天将荧光标记的梭菌二恶英异位到巨噬细胞和嗜中性粒细胞的肠道流明中，这种微量作用模仿了梭三二恶虫难治感染的自然路径。
然而，嗜中性粒细胞和巨噬细胞在微粒后长达12小时内未明显向胃肠道迁移。与此同时，标记的梭三二恶英的荧光在微重力后大约五个小时后消失。感染后24小时对肠道样本进行解剖，显示细菌生长。
对照组没有细菌生长。在后来的时间点，孵育样本只生长在含有TCA的介质中，这表明肠道中总的梭三二恶英困难已经形成孢子。16S rDNA PCR 将生长的细菌确定为梭三二胺困难，它产生大约 800 个碱基对的可预测大小的特定 PCR 安普利素。
生长在 CHROMID 板上的细菌培养物以典型的黑菌落出现，这进一步表明斑马鱼肠中的细菌是梭三二二恶英。与厌氧细菌一起工作要求有氧步骤保持短，因为这当然会影响细菌的生物学。斑马鱼中的先天免疫细胞可以纵。
例如，他们可以破译先天免疫细胞对感染的反应机制。我们的方法表明，斑马鱼是研究人类肠道厌氧病原体的工具。使用多抗病原体需要采取适当的安全措施。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
