Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten
Chapters
Summary September 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het hier gepresenteerde protocol toont een techniek om een knaagdiermodel van hersenletsel te creëren. De hier beschreven methode maakt gebruik van laserbestraling en richt zich op de motorische cortex.
Transcript
Ons protocol biedt een nieuwe methodologie voor het creëren van traumatisch hersenletsel bij ratten met behulp van laser bestraling om een focus impact in de motorische cortex te creëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek zijn de lage variabiliteit in infarctgebied, de lage sterftecijfers en de relatieve eenvoud van de procedure waarvoor geen deskundige handlers nodig zijn. Het aantonen van de procedure zal Dmitry Natanel, een onderzoeker van ons laboratorium.
Om een laser-geïnduceerde hersenletsel uit te voeren, eerst toewijzen 20, 300 tot 350 gram Sprague Dawley ratten in de lasergroep en 20 aan de controle Sham-operated groep. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op terugtrekking reflex, plaats een rat op een rectale temperatuur geregeld verwarming pad en gebruik een scheerapparaat om genoeg haar te verwijderen van de schade site met een ongeveer twee centimeter haarvrije marge rond de incisie. Desinfecteer de blootgestelde huid met 70% ethanol en plaats de rat in de gevoelige positie in een stereotaxic hoofdhouder.
Maak een incisie van drie centimeter om zijdelingse reflectie van de hoofdhuid het gebied tussen bregma en lambda bloot te stellen. Met een Nd:YAG-laser met piekgolflengte van 1064 nanometer op twee millimeter afstand van de schedel, die 50 joules keer 10 punten met een pulsduur van één seconde toedient aan het blootgestelde gebied van de schedel boven de rechterhersenhelft. Nadat de laser blessure is geleverd, verwijder de rat uit het apparaat en sluit de hoofdhuid met 3-0 zijde chirurgische hechtingen.
Plaats vervolgens de rat in zijn kooi met controle tot volledige recumbency. 24 uur na de procedure, gebruik maken van een 43 punt score systeem om de neurologische ernst score te evalueren. Het testen van de dieren op neurologische tekorten, gedragsstoornissen, beam balancing taak, en reflexen, en het toewijzen van hogere scores voor meer ernstige handicaps.
Na de beoordeling, oogst de hersenen van elk experimenteel en controle dier volgens standaard protocollen. Om het volume van het herseninfarct te beoordelen, doorsnee de geoogste hersenen in zes twee millimeter dikke coronale plakjes en incuberen elk plakje in 0,05%TTC gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na kleuring, scan deze plakjes met een optische scanner met een 1600 bij 1600 stippen per inch resolutie.
De onbevlekte gebieden van de vaste hersenen plakjes worden gedefinieerd als infarct. Om de incidentie van bloed-hersenbarrière breuk te evalueren, 24 uur na de laser geïnduceerde letsel belasting van een spuit met 2%Evans blauwe kleurstof verdund in vier milliliters per kilogram zoutoplossing en leveren de oplossing intraveneus aan de gewonde en controle ratten via de cannulated staart ader. Laat de oplossing een uur circuleren voordat u chirurgische pincets en scharen gebruikt om de borst van het eerste dier te openen.
Doorsfuus het blootgestelde hart met gekoelde 0,9% zoutoplossing via de linkerventrikel op 110 millimeter kwik van druk tot een kleurloze profusievloeistof wordt waargenomen vanuit het rechteratrium. Oogst vervolgens de hersenen en verkrijg twee millimeter rostral caudal plakjes. Scheid de linker hersenen plakjes van de rechter hersenen plakjes om de evaluatie van de gewonde en niet-gewonde hemisferen afzonderlijk mogelijk te maken, en weeg de monsters.
Homogeniseer de monsters met behulp van een mortier en stamper en incubeer de weefselmonsters in 50% trichloorazijnzuur gedurende 24 uur. De volgende dag, centrifugeren de gehomogeniseerde hersenweefsel monsters gedurende 20 minuten op 10,000 keer G en kamertemperatuur, en meng een milliliter van de supernatant met 1,5 milliliter van 96%ethanol bij een tot drie verhouding. Gebruik vervolgens een fluorescentiedetector bij een excitatie van 620 nanometer en de 680 nanometer emissiegolflengte om de breuk met de bloedhersenenbarrière te beoordelen.
Zoals waargenomen door histologische analyse, Evans blauwe vlekken kan worden gebruikt om de incidentie van hersenletsel bij laser en MCAO model dieren onthullen. In deze representatieve analyse werden geen sterfgevallen of subarachnoïdale bloedingen geregistreerd in de controle- of experimentele groepen, en de MCAO-groep had een 20%-percentage van zowel sterfte als subarachnoïdale bloedingen. De relatieve veranderingen in de lichaamstemperatuur in de ratten van beide groepen waren ook vergelijkbaar, ondanks een verschil in de variabiliteit van beide groepen.
De neurologische ernst scores waren aanzienlijk slechter in zowel de laser en MCAO modellen in vergelijking met de Sham-operated controlegroep. Laser-geïnduceerd tot hersenletsel veroorzaakte ook een aanzienlijke toename van het infarct volume op het doel halfrond in vergelijking met de Sham-operated controlegroep. Het infarctvolume van het lasermodel was echter kleiner in vergelijking met de dieren die door de MCAO-techniek werden verwond.
Geen verschil in hersenoedeem werd waargenomen tussen de laser-geïnduceerde hersenletsel model en de Sham-operated controlegroep. Er was echter een significant verschil in hersenoedeem tussen het lasermodel en MCAO gewonde groepen. Vergeleken met de Sham-operated control group, de laser-geïnduceerde hersenletsel en MCAO technieken veroorzaakten beide een aanzienlijke toename van de bloed-hersenbarrière breuk op de niet-gewonden en doel hemisferen.
Tijdens een poging dit model, vergeet niet om precies te richten op de motorische cortex gebied en om de energie te standaardiseren, het aantal punten wordt bestraald, en de totale expositie tijd. Na deze procedure kan een brede overvloed aan gedragstests worden uitgevoerd, zoals balklopen, Froedert en andere evaluaties.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
