Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten

Samenvatting

Het hier gepresenteerde protocol toont een techniek om een knaagdiermodel van hersenletsel te creëren. De hier beschreven methode maakt gebruik van laserbestraling en richt zich op de motorische cortex.

Samenvatting

Een veel voorkomende techniek voor het induceren van een beroerte in experimentele knaagdier modellen omvat de voorbijgaande (vaak aangeduid als MCAO-t) of permanente (aangeduid als MCAO-p) occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) met behulp van een katheter. Deze algemeen aanvaarde techniek heeft echter een aantal beperkingen, waardoor het uitgebreide gebruik ervan wordt beperkt. Slaginductie door deze methode wordt vaak gekenmerkt door hoge variabiliteit in de lokalisatie en grootte van het ischemische gebied, periodieke gebeurtenissen van bloeding, en hoge sterftecijfers. Ook de succesvolle voltooiing van een van de voorbijgaande of permanente procedures vereist expertise en duurt vaak ongeveer 30 minuten. In dit protocol wordt een laserbestralingstechniek gepresenteerd die kan dienen als een alternatieve methode voor het opwekken en bestuderen van hersenletsel in knaagdiermodellen.

In vergelijking met ratten in de controle- en MCAO-groepen vertoonde het hersenletsel door laserinductie verminderde variabiliteit in lichaamstemperatuur, infarctvolume, hersenoedeem, intracraniale bloeding en sterfte. Bovendien veroorzaakte het gebruik van een laser-geïnduceerde verwonding schade aan de hersenweefsels alleen in de motorische cortex in tegenstelling tot in de MCAO-experimenten waar vernietiging van zowel de motorische cortex als striatale weefsels wordt waargenomen.

Bevindingen uit dit onderzoek suggereren dat laser bestraling kan dienen als een alternatieve en effectieve techniek voor het induceren van hersenletsel in de motorische cortex. De methode verkort ook de tijd voor het voltooien van de procedure en vereist geen deskundige handlers.

Inleiding

Wereldwijd, beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak en de derde belangrijkste oorzaak van invaliditeit¹. Beroerte leidt ook tot ernstige invaliditeit, vaak die extra zorg van medisch personeel en familieleden. Er is daarom een noodzaak om de complicaties in verband met de aandoening te begrijpen en het verbeteren van het potentieel voor meer positieve resultaten.

Het gebruik van diermodellen is de eerste stap naar het begrijpen van ziekten. Om de beste onderzoeksresultaten te garanderen, zou een typisch model een eenvoudige techniek, betaalbaarheid, hoge reproduceerbaarheid en minimale variabiliteit bevatten. De determinanten in ischemische beroerte modellen omvatten hersenoedeem volume, infarct grootte, de omvang van de bloed-hersenbarrière (BBB) afbraak, en functionele stoornis over het algemeen geëvalueerd via neurologische ernst score².

De meest gebruikte slag inductie techniek in knaagdier modellen occludes de middelste cerebrale slagader (MCA) tijdelijk of permanent³. Deze techniek produceert een lijn model vergelijkbaar met die bij de mens: het heeft een penumbra rond het gestoste gebied, is zeer reproduceerbaar, en reguleert ischemie duur en reperfusie⁴. Toch heeft de MCAO-methode enkele complicaties. De techniek is gevoelig voor intracraniale bloeding en letsel aan het ipsilaterale netvlies met een disfunctie van de visuele cortex en gemeenschappelijke hyperthermie die vaak leiden tot extra uitkomsten^5,6,7. Andere beperkingen zijn hoge variaties in geïnduceerde beroerte (als gevolg van de waarschijnlijke uitbreiding van de ischemie tot onbedoelde gebieden, zoals de externe halsslagader regio), onvoldoende occlusie van de MCA, en vroegtijdige reperfusie. Ook ratten van verschillende stammen en maten vertonen verschillende infarct volumes⁸. Naast alle genoemde nadelen kan het MCAO-model geen kleine geïsoleerde beroertes veroorzaken in diepe hersengebieden, omdat het technisch beperkt is in termen van de vereiste van minimale vatgrootte voor katheterisatie. Dit maakt de behoefte aan een alternatief model des te kritischer. Een andere methode, fototrombose, biedt een mogelijk alternatief voor MCAO-procedures, maar verbetert de efficiëntie niet⁹. Deze techniek richt zich op slag met licht en biedt een aantal verbeteringen ten opzichte van de vorige modellen. Fototrombose vereist echter een invasieve craniotomie die wordt geassocieerd met secundaire compicaties^9.

In het licht van geschetste tekortkomingen, het protocol hier gepresenteerd biedt een capabele alternatieve laser techniek voor het induceren van hersenletsel bij knaagdieren. Het werkingsmechanisme van de lasertechniek is gebaseerd op de fotothermale effecten van de laser die worden bijgebracht op levende weefsels, wat leidt tot de absorptie van lichtstralen door lichaamsweefsels en hun omzetting in warmte. De voordelen van het gebruik van een lasertechniek zijn de veiligheid en het gemak van manipulatie. Het vermogen van een laser om warmte te produceren om te stoppen met bloeden maakt het erg belangrijk in de geneeskunde, terwijl het vermogen om verschillende stralen op een bepaald meetpunt te versterken ervoor zorgt dat lasers voorkomen dat ze gezonde weefsels vernietigen die het doelpunt¹⁰in de weg staan. De laserstraal die in dit protocol wordt gebruikt, kan door een laag vloeibaar medium, zoals bot, gaan zonder zijn energie uit te stoten en/of vernietiging te veroorzaken. Zodra het een hoog vloeibaar medium bereikt, zoals hersenweefsels, gebruikt het zijn energie om de doelweefsels te vernietigen. De techniek kan daarom alleen hersenletsel veroorzaken in het juiste gebied van de hersenen.

De hier gepresenteerde techniek toonde een enorme hoeveelheid vermogen om de niveaus van bestraling te reguleren, waardoor de gekozen variaties van hersenletsel bedoeld vanaf het begin. In tegenstelling tot de oorspronkelijke MCAO die zowel de cortex als het striatum beïnvloedt, was de lasertechniek in staat om de impact van hersenletsel te reguleren, waardoor letsel alleen op de beoogde motorische cortex werd veroorzaakt. Hierin, de laser-geïnduceerde hersenletsel protocol en een samenvatting van de representatieve resultaten voor de procedure uitgevoerd op de hersenschors van ratten zijn voorzien.

Protocol

De volgende procedure werd uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden ook goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev.

1. Selectie en bereiding van dieren

1. Selecteer 65 mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 300 tot 350 g zonder openlijke pathologie voor deze procedure. De kleinere omvang brengt technische problemen met zich mee voor de MCAO-procedure.
2. Wijs 3 ratten per kooi toe en laat ze zich minstens 3 dagen aanpassen.

2. MCAO-procedure

1. Selecteer 25 ratten voor MCAO, waardoor 10-20% sterfte in verband met de procedure¹¹.
2. Voer MCAO uit met behulp van een standaardtechniek, zoals eerder beschreven in detail¹².

3. Laser-geïnduceerde hersenletsel experimentele procedure

1. Wijs 20 ratten toe aan een groep die als lasergroep is gemarkeerd en 20 ratten aan een andere controlegroep (schijn-bediend).
2. Onderwier de ratten van de lasergroep op de volgende wijze op laserstraling op 50J X 10-punten: points
   1. Verdoof de rat met een mengsel van 2% isoflurane in zuurstof waardoor de spontane ventilatie mogelijk is. Controleer op voldoende verdovingsdiepte door de staart met tangen te knijpen om de afwezigheid van de terugtrekkingsreflex te zien.
   2. Houd de kernlichaamstemperatuur van de rat gedurende de gehele experimentele procedure op 37 °C met behulp van een rectale temperatuur geregeld verwarmingskussen.
   3. Verwijder lokaal haar met een scheerapparaat en ontsmet met 70% alcohol en 0,5% chloorhexidine gluconaat. Herhaal de desinfectiestap nog twee keer.
      LET OP: De grootte van de chirurgische incisie moet ongeveer 3 cm zijn. Verwijder het haar ten minste 2 cm rond het incisiegebied.
   4. Plaats de rat op een stereotaxic hoofdhouder in een gevoelige positie en maak een incisie van 3 cm om de hoofdhuid zijdelings te reflecteren en om het gebied tussen Bregma en Lambda bloot te stellen.
   5. Houd anesthesie door de neuskegel.
   6. Gebruik neodymium-YAG (Nd-YAG) laser (piekgolflengte 1064 nm) om 50J X 10 punten, met 1 s puls duur, toe te dienen aan het blootgestelde gebied van de schedel boven de rechterhersenhelft.
   7. Zorg ervoor dat het lasergenererende deel van het apparaat zich op 2 mm afstand van het blootgestelde gebied bevindt om een laserstraal te produceren. 50J X 10 punten werd geselecteerd na zorgvuldige evaluatie van verschillende energie/oppervlaktecombinaties. Deze combinatie is efficiënt en veroorzaakt geen botvernietiging van de schedel na toediening voor minder dan een seconde¹⁰.
      LET OP: 2 mm is de afstand tussen de terminal van de laserstraal (van de optische kabel die het wordt doorgegeven) en het schedelbot. In het geval dat een scherpstellens wordt gebruikt, moet de afstand worden berekend rekening houdend met de hellingshoek van de lens om de bundel in het gewenste beschadigingsgebied te richten. Zorg voor een goede veiligheid bij het gebruik van een laserapparaat, inclusief de juiste training en oogbescherming.
   8. Verwijder de rat van het apparaat en sluit de hoofdhuid met 3-0 zijde chirurgische hechtingen.
   9. Stop anesthesie en breng de rat terug naar zijn kooi voor herstel. Toedien 0,1 mL van 0,25% bupivacaine lokaal om de postoperatieve pijn onmiddellijk na de operatie te verminderen.
      LET OP: De hele procedure moet minder dan 5 min duren als deze correct wordt uitgevoerd.
3. Observeer de rat op tekenen van nood tijdens het herstel van de anesthesie na de anesthesie. Vóór het ontstaan van anesthesie, geef 0,01mg/kg intramusculaire buprenorfine voor postoperatieve analgesie en ga verder met herhaalde doses om de 12 uur gedurende ten minste 48 uur.
4. Subject control ratten aan dezelfde voorwaarden zonder ze te onderwerpen aan de laser.

4. Neurologische ernstscore (NSS)

1. Evalueer de neurologische ernst score 24 uur na de laser-geïnduceerde hersenletsel met behulp van een 43-puntscore¹³. Test de dieren op neurologische tekorten, gedragsstoornissen, beam-balancing taak, en reflexen, het toewijzen van hogere scores voor meer ernstige handicaps, zoals eerder gedetailleerde¹³.

5. Manipulaties na de schade

1. Na de evaluatie van NSS, euthanaseren de ratten door ze bloot te stellen aan 20% zuurstof en 80% CO2 (via inspiratie) en transcardially perfuse de rat met heparinized fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl).
   LET OP: Zorg ervoor dat CO₂ tegen een vooraf bepaald tarief wordt geleverd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee. Deze stap kan ook worden uitgevoerd onder 5% isoflurane anesthesie.
2. Oogst hersenen en bereid je voor op verder onderzoek zoals beschreven in een eerder protocol¹¹.
3. Evalueer voor subarachnoïdale bloeding (SAH) door visueel onderzoek van de hele hersenen na de isolatie van de schedel. Indien nodig kan hiervoor een microscoop of vergrootglas worden gebruikt.

6. Evaluatie van het hersenletsel

1. Het bepalen van het volume van het herseninfarct en hersenoedeem door TTC-kleuring
   OPMERKING: 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) vlekken is een handige procedure voor herseninfarct detectie¹¹.
   1. Doorsnede de geoogste hersenen in 6 coronale plakjes, elk 2 mm dikte.
   2. Incubeer de set van plakjes van elke hersenen gedurende 30 min bij 37 °C in 0,05% TTC.
   3. Na kleuring, scan de plakjes met een optische scanner met een resolutie van 1600 X 1600 dpi.
   4. De onbevlekte gebieden van de vaste hersenen plakjes worden gedefinieerd als infarct¹².
   5. Met behulp van een software voor beeldverwerking (bijvoorbeeld freeware Image J)meet u het onbevlekte infarctgebied, ipsi- en contralaterale halfrondsen voor elk van de 6 coronale plakjes.
   6. Bereken het infarct volume als een percentage van de totale hersenen:
      
   7. Bereken hersenoedeem met behulp van Kaplan methode:
      
2. Het bepalen van de omvang van de bloed-hersenbarrière (BBB) breuk
   OPMERKING: Beoordeel BBB-breuk 24 uur na het door laser geïnduceerde hersenletsel als volgt:
   1. Beheer 2% Evans Blue gemengd met 4 mL/kg zoutoplossing intraveneus aan ratten via de gebottuleerde staartader en laat de oplossing 1 uur circuleren.
   2. Euthanaseer ratten door ze bloot te stellen aan 20% zuurstof en 80% CO₂ (via inspiratie) 24 uur na de laatste NSS, zoals eerder beschreven¹³.
   3. Oogst de intravasculair gelokaliseerde kleurstof als volgt:
      1. Open de kisten van de ratten met chirurgische pincettes en chirurgische schaar.
      2. Doorsfuus de dieren met gekoelde 0,9% zoutoplossing via de linker ventrikel met 110 mmHg tot het verkrijgen van een kleurloze perfusievloeistof uit het rechteratrium.
   4. Oogst de hersenen en snijd ze rostrocaudally in plakjes van 2 mm.
   5. Scheid de linker hersenen plakjes van de rechter porties om gewonde en niet-gewonde hemisferen afzonderlijk te evalueren.
   6. Weeg, homogenize met behulp van mortel en stamper, en vervolgens inculuberen de hersenweefsels in 50% trichloorazijnzuur voor 24 uur.
   7. Centrifugeer de gehomogeniseerde hersenen plakjes op 10.000 × g gedurende 20 min.
   8. Meng 1 mL van de supernatant uit de gecentrifugeerde hersenen met 1,5 mL van 96% ethanol op 1:3 en beoordeel de bloed-hersenbarrière breuk met behulp van een fluorescentie detector op 620 nm excitatie golflengte (10 nm bandbreedte) en 680 nm emissiegolflengte (10 nm bandbreedte).
      OPMERKING: Beide groepen ratten ondergaan hetzelfde protocol voor het bepalen van BBB-afbraak.

Resultaten

Er werden geen sterfgevallen of SAH geregistreerd in de controle- of experimentele groepen(tabel 1). De MCAO-groep had een 20% percentage van zowel sterfte als SAH.

De relatieve veranderingen in de lichaamstemperatuur bij de ratten van beide groepen waren ook vergelijkbaar, ondanks een verschil in variabiliteit van beide groepen (tabel 1).

Er was een aanzienlijk slechtere NSS in zowel de laser (16 ± 1.1) en MCAO (20 ± 1.5) modellen,...

Discussie

Het is eerlijk om aan te nemen dat de lasertechniek minimaal invasief is, gezien het feit dat er geen sterfgevallen of SAH in de lasergroep zijn opgetreden. De belangrijkste doodsoorzaak en SAH is de schade aan bloedvaten die leidt tot een verhoging van de intracraniale druk (ICP), zoals blijkt uit de oorspronkelijke MCAO-technieken¹⁰. De afwezigheid van overlijden en SAH in de lasergroep is waarschijnlijk te wijten aan de specifieke effecten van lasers: ze hebben geen directe invloed op de bloedv...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% trichloorazijnzuur	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Hersenen & Weefselmatrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Canule Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Compacte Analytische Weegschalen	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digitale Weegschaal	SIGMA - ALDRICH	Rs 4.000
Dissectie schaar	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipet	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorfbuis	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Ontvlambare vloeistof
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluorescentiedetector	Tecan, Männedorf Zwitserland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Verwarming met thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusiemanchet	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscoop	Olympus
Optische scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petrischalen	SIGMA - ALDRICH	P5606
Scalpelmesjes 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-gedopeerd yttriumaluminiumgranaat) lasermachine	Laser Industries Ltd
Stereotactische hoofdhouder	KOPF	900LS
Steriele spuit 2 ml	Braun	4606027V
Spuit-naald 27 G	Braun	305620