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Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie
Chapters
Summary March 14th, 2020
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Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.
Transcript
Cette vidéo démontre la production et l’application de tranches de foie découpées avec précision comme modèle expérimental ex vivo de biologie des tissus hépatiques. Les tranches de foie découpées avec précision occupent un créneau expérimental qui existe entre les études in vivo sur les animaux et les méthodes de culture cellulaire in vitro. Cette technique a plusieurs avantages clés par rapport aux études sur les animaux in vivo, y compris la capacité d’utiliser des échantillons de contrôle et de traitement du même foie, l’isolement des tissus hépatiques pour éliminer les effets hors cible d’autres systèmes organiques, et la capacité d’utiliser des réaccentistes qui pourraient avoir un effet négatif s’ils étaient appliqués à toute une souris vivante, par exemple, inhibiteurs de voies toxiques.
La technique consiste à utiliser une lame vibrante latéralement pour couper des tranches de foie ultra-minces de tissu hépatique viable suivies d’une culture tissulaire de laboratoire. Les vibrations de la lame empêchent les déchirures causées par le stress du cisaillement. Dans cet exemple, nous allons montrer les techniques de préparation de tranches de foie ex vivo viables, et démontrer l’utilité de la culture des tranches de foie dans des expériences par exemple où ce tissu ex vivo est traité avec des acides biliaires pour stimuler les lésions hépatiques cholestatiques pour évaluer les mécanismes de la fibrose hépatique.
Insérez la lame dans le bras de coupe. Désinfecter la lame et le bras de coupe avec une solution 70% éthanol. Veillez toujours à éviter tout contact avec la lame.
Désinfectez le plateau tampon avec une solution 70% éthanol, et essuyez avec un tissu stérile. Insérez le plateau tampon dans le vibratome et serrez la vis de montage. Réglez le bras de coupe à la hauteur maximale disponible.
Vérifiez l’angle de la lame. Sur notre vibratome, nous utilisons un angle de 10 degrés de l’horizontale, avec la lame en pente vers le bas vers l’échantillon. Assurez-vous que l’angle de la lame est bien fixé.
Désinfectez le porte-spécimen, encore une fois, avec une solution à 70 % d’éthanol. Connectez l’eau de refroidissement pour le refroidisseur thermoélectrique Peltier, situé sous le plateau tampon. Certains modèles vibratomes utilisent un bain de glace pour le refroidissement à la place.
Fixez le tube d’évacuation d’eau à un drain et allumez l’eau. Réglez la glacière à quatre degrés Celsius. Ajouter le tampon krebs-henseleit glacé au plateau tampon.
Tous les instruments et matériaux chirurgicaux doivent être stériles. Les souris doivent être profondément anesthésiées ou euthanasiées. Les surfaces de peau sur les souris ont été désinfectées en mouillant avec la solution 70% éthanol.
Faire une incision de midline dans la peau de la base de la cavité abdominale au diaphragme. À l’aide de forceps et de ciseaux propres, ouvrez la cavité abdominale. Retirez le foie rapidement, sans endommager les lobes.
Poussez le foie vers le bas, et coupez le tissu conjonctif au sommet du foie. Poussez le foie vers le haut. Tenez la zone vasculaire centrale du foie avec les forceps et tirez vers le haut.
Couper les vaisseaux sanguins des tissus conjonctifs. Prenez soin de ne pas endommager les lobes du foie, et aussi, prenez soin de ne pas couper dans le tractus gastro-intestinal. Placer le foie retiré dans un plat stérile de tampon krebs-henseleit glacé.
Séparez le foie en lobes individuels. Sélectionnez un lobe du foie et placez le côté plat vers le bas sur un nouveau plat stérile. Gardez d’autres lobes sur la glace dans la zone tampon de Krebs-Henseleit.
Couper les bords des lobes du foie. Le parage est important, particulièrement au bord qui entrera en contact avec la lame de coupe d’abord, car avoir un bord de tissu relativement perpendiculaire à la lame de coupe empêchera la compression de tissu qui peut se produire aux angles peu profonds. Couper le tissu autour des trois autres bords enlève une grande partie des capsules fibreux au bord du tissu, et permet généralement l’enlèvement plus facile des tranches de tissu.
Placez une fine couche de colle cyanoacrylate sur le bord avant du porte-spécimen, légèrement plus grande que les lobes de foie parés. Retirez tout résidu de tampon du tissu à l’aide de matières absorbantes stériles. Placez le lobe du foie sur de la colle cyanoacrylate, le plus grand bord faisant face à l’avant.
Laisser guérir dans l’air pendant une à deux minutes. Placez le tissu attaché au porte-spécimen dans le vibratome. Réglez la vitesse vibratoire.
Abaissez la lame de coupe jusqu’à ce qu’elle soit située juste au-dessus du lobe du foie. Exécutez le bras de coupe vibrant sur l’échantillon. La vibration de la lame sur cette machine est activée par la pédale.
Retournez la lame vers l’arrière et abaissez la hauteur de la lame de 250 micromètres. Répétez ce processus jusqu’à ce que la couche supérieure du tissu soit enlevée. Jetez la première ou deux tranches, car celles-ci contiendront la capsule de Glisson, et ne contiendront donc pas beaucoup de tissu hépatique fonctionnel.
Pour couper les tranches de foie, avancez lentement la lame vibrante dans le tissu en tournant la poignée. Utilisez un petit pinceau pour guider doucement le tissu pendant le processus de coupe. Utilisez le pinceau pour ramasser la section des tissus coupés, puis placez la section tissulaire dans un tube stérile contenant krebs-henseleit tampon pour le stockage.
Lorsqu’il n’est pas utilisé, gardez ce tube sur la glace. Une partie du temps, le tissu ne déchirer pendant le processus de coupe, mais pour la plupart des fins, le tissu est encore utilisable. Couper les tranches de tissu jusqu’à près de la colle cyanoacrylate.
Ne coupez pas dans la colle. Répétez l’effet avec les autres lobes hépatiques, qui sont assis sur la glace, jusqu’à ce que le nombre requis de tranches de tissu soit obtenu. Pour nettoyer le porte-spécimen, soit utiliser une lame pour gratter le mélange colle-tissu, ou le mélange peut être ramolli à l’aide de solvants tels que l’acétone ou le sulfoxyde de diméthyle.
Dans une hotte de culture tissulaire, pipette un mL de milieu Williams’E contenant 10% de sérum bovin fœtal et antimicrobiens dans une plaque de 12 puits. Retirer les tranches de tissu en tourbillonnant doucement le mélange et la pointe dans un plat stérile. Couper le tissu dans une taille à peu près uniforme.
Dans cet exemple, nous avons visé des tranches de tissu avec une surface d’environ 50 millimètres carrés. Prenez soin d’examiner les tranches de tissu pour la consistance. Des tranches plus foncées suggèrent que l’épaisseur des tissus est augmentée et qu’elle doit être jetée.
Des tranches plus légères suggèrent la présence de colle cyanoacrylate durcie et devraient être jetées. Transférer les tranches de tissu dans la plaque de 12 puits contenant un millilitre de médias. Incuber les tranches de foie dans des conditions normales de culture tissulaire.
Si possible, utilisez des méthodes pour améliorer la disponibilité de l’oxygène aux tranches de tissu. Le lendemain, changer les médias à l’aide d’une pipette manuelle pour prévenir la perte de tissu par aspiration. Les tranches de foie coupées avec précision sont maintenant prêtes à être utilisées expérimentalement.
Pour notre application, nous avons traité les tranches de foie avec des acides biliaires pendant deux jours, et homogénéisé dans le tampon de lyse pour l’extraction d’ARN messager et l’analyse qPCR. Pour examiner la viabilité des tranches de foie coupées avec précision au fil du temps, nous avons utilisé les niveaux d’ATP comme indicateur de viabilité cellulaire. Les niveaux d’ATP ont été normalisés en protéine, et ont été mesurés à plusieurs points de temps après l’isolement.
Des niveaux d’ATP ont été diminués dans les échantillons immédiats et d’une heure, toutefois ceci récupéré par trois heures. Par la suite, les niveaux d’ATP ont été maintenus pendant cinq jours, bien qu’ils aient tendance à la baisse au fil du temps. La coloration H&E a été utilisée pour examiner les tranches de foie coupées avec précision qui ont été maintenues en culture jusqu’à cinq jours.
La morphologie de tissu était suggestive d’une certaine nécrose se produisant au deuxième jour, avec la nécrose grave se produisant par jour cinq. En raison de la nécrose qui se passe entre les deux jours et cinq, nous recommandons l’utilité expérimentale de cette technique est limitée à environ trois jours. Cependant, ceci pourrait être amélioré en utilisant de meilleures techniques de livraison d’oxygène aux tranches de tissu.
Les tranches de foie coupées avec précision semblent également avoir épaississement des fibres de collagène par rapport au temps dans la culture. Ceci est suggestif des processus fibrogenic spontanés se produisant. Dans l’exemple d’expérience, les tranches de foie coupées avec précision ont été traitées avec trois acides biliaires distincts pendant deux jours, pour imiter la cholase hépatique.
En regardant l’expression de l’ARNm de trois gènes spécifiques aux cholangiocytes, les deux acides biliaires conjugués, les acides glycocholiques et taurocholiques, ont considérablement augmenté l’expression de la cytokératine-19 et de la connexine-43. Ceci est compatible avec le développement de cholangiocyte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des tranches de foie coupées avec précision, et comment effectuer la culture des tissus de base.
Les tranches de foie coupées avec précision peuvent être utilisées pour un très large éventail d’applications, y compris des études expérimentales sur l’expression de l’ARN, l’expression des protéines, l’épigénétique, la liaison de l’ADN, le métabolisme, les mécanismes d’infection, l’invasion du cancer, la pharmacologie, la biologie cellulaire et les études de sécrétion, pour n’en nommer que quelques-unes.
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