Murine Precision-Cut Lever Plakjes als een Ex Vivo Model van leverbiologie

Deze video toont de productie en toepassing van precisie-gesneden lever plakjes als een experimenteel ex vivo model van leverweefsel biologie. Precisiegesneden leversegmenten bezetten een experimentele niche die bestaat tussen in vivo dierstudies en in vitro celkweekmethoden. Deze techniek heeft verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van in vivo dierstudies, waaronder de mogelijkheid om controle- en behandelingsmonsters uit dezelfde lever te gebruiken, de isolatie van leverweefsel om off-target effecten uit andere orgaansystemen te verwijderen, en de mogelijkheid om reagentia te gebruiken die een negatief effect kunnen hebben als ze worden toegepast op een hele levende muis, bijvoorbeeld toxische routeremmers.

De techniek omvat het gebruik van een lateraal trillend mes te snijden ultra-dunne, lever plakjes van levensvatbare leverweefsel, gevolgd door laboratoriumweefsel cultuur. De trillingen van het mes voorkomen scheuren veroorzaakt door schuinspanning. In dit voorbeeld tonen we de technieken voor preparaten van levensvatbare ex vivo leverplakjes en tonen we het nut van leversegmentcultuur in voorbeeldexperimenten waarbij dit ex vivo weefsel wordt behandeld met galzuren om cholestatische leverletsel te stimuleren om de mechanismen van leverfibrogenese te beoordelen.

Steek het mes in de snijarm. Desinfecteer het mes en de snijarm met een 70% ethanoloplossing. Wees altijd voorzichtig om contact met het mes te vermijden.

Desinfecteer de bufferlade met een 70% ethanoloplossing en veeg af met een steriel weefsel. Steek de bufferlade in het vibratome en draai de montageschroef aan. Stel de snijarm op de maximaal beschikbare hoogte.

Controleer de bladhoek. Op onze vibratome gebruiken we een hoek van 10 graden van horizontaal, waarbij het blad naar beneden schuin naar het monster loopt. Zorg ervoor dat de bladhoek stevig vast is.

Desinfecteer de monsterhouder opnieuw met een 70%ethanoloplossing. Sluit het koelwater aan voor de Peltier thermo-elektrische koeler, die zich onder de bufferlade bevindt. Sommige vibratome modellen gebruiken een ijsbad voor koeling in plaats daarvan.

Bevestig de waterbuis aan een afvoer, en zet het water. Zet de koeler op vier graden Celsius. Voeg ijskoude Krebs-Henseleit buffer toe aan de bufferbak.

Alle chirurgische instrumenten en materialen moeten steriel zijn. Muizen moeten diep verdoofd of geëuthanaseerd worden. Huidoppervlakken op de muizen werden gedesinfecteerd door bevochtiging met 70% ethanoloplossing.

Maak een middellijn incisie in de huid van de basis van de buikholte naar het middenrif. Open met behulp van schone tangen en scharen de buikholte. Verwijder de lever snel, zonder beschadiging van de lobben.

Duw de lever naar beneden, en snijd het bindweefsel aan de bovenkant van de lever. Duw de lever omhoog. Houd het centrum vasculaire gebied van de lever met de tangen en trek omhoog.

Snijd bindweefsel bloedvaten. Zorg ervoor dat de leverlellen niet worden beschadigd en zorg er ook voor dat ze niet in het maag-darmkanaal snijden. Plaats de verwijderde lever in een steriele schotel van ijskoude Krebs-Henseleit buffer.

Scheid de lever in individuele lobben. Selecteer een leverkwab en plaats platte kant naar beneden op een nieuwe steriele schotel. Houd andere lobben op ijs in Krebs-Henseleit buffer.

Snijd de randen van de leverkwabben. Trimmen is belangrijk, met name aan de rand die het snijmes eerst zal contacteren, omdat het hebben van een weefselrand die relatief loodrecht staat op het snijblad weefselcompressie zal voorkomen die onder ondiepe hoeken kan optreden. Het snijden van het weefsel rond de andere drie randen verwijdert veel van de vezelige capsules aan de weefselrand, en meestal maakt het gemakkelijker verwijderen van de weefselschijfjes.

Plaats een dunne laag cyanoacrylaatlijm op de voorkant van de monsterhouder, iets groter dan de bijgesneden leverkwabben. Verwijder eventuele resten van de buffer uit het weefsel met behulp van steriel absorberend materiaal. Plaats leverkwab op cyanoacrylaatlijm, met de grootste rand naar voren gericht.

Laat een tot twee minuten in de lucht genezen. Plaats het weefsel dat aan de monsterhouder is bevestigd in het vibratome. Stel de vibratomesnelheid in.

Laat het snijmes zakken tot het zich net boven de leverkwab bevindt. Voer de trillende snijarm over het monster. Trillingen van het mes op deze machine worden geactiveerd door het voetpedaal.

Breng het blad naar achteren terug en verlaag de bladhoogte met 250 micrometer. Herhaal dit proces totdat de bovenste laag van weefsel is verwijderd. Gooi de eerste een of twee plakjes, omdat deze glisson’s capsule bevatten, en daarom zal niet veel functioneel leverweefsel bevatten.

Om leverplakjes te snijden, schuif het trillende mes langzaam vooruit in het weefsel door het handvat te draaien. Gebruik een kleine kwast om het weefsel voorzichtig te begeleiden tijdens het snijproces. Gebruik de penseel op te halen het gesneden weefsel sectie, en plaats de weefselsectie in een steriele buis met Krebs-Henseleit buffer voor opslag.

Wanneer u niet in gebruik bent, houdt u deze buis op ijs. Een deel van de tijd scheurt het weefsel tijdens het snijproces, maar voor de meeste doeleinden is het weefsel nog steeds bruikbaar. Snijd de plakjes weefsel tot in de buurt van de cyanoacrylaat lijm.

Snij niet in de lijm. Herhaal dit met de andere leverkwabben, die op ijs zitten, totdat het vereiste aantal weefselschijfjes is verkregen. Om de monsterhouder schoon te maken, gebruikt u een mes om het lijmweefselmengsel af te schrapen, of het mengsel kan worden verzacht met behulp van oplosmiddelen zoals aceton of dimethylsulfoxide.

In een weefselkweekkap, pipet een mL van Williams’E medium met 10% foetale runder serum en antimicrobiële stoffen in een 12-put plaat. Verwijder de plakjes weefsel door zachtjes wervelen het mengsel en tip in een steriele schotel. Snijd het weefsel in een ongeveer uniforme grootte.

In dit voorbeeld mikten we op weefselschijfjes met een oppervlakte van ongeveer 50 millimeter vierkant. Zorg ervoor dat de weefselschijfjes onderzoeken op consistentie. Donkere plakjes suggereren dat de weefseldikte wordt verhoogd en moet worden weggegooid.

Lichtere plakjes suggereren de aanwezigheid van genezen cyanoacrylaatlijm en moeten worden weggegooid. Breng de weefselschijfjes over op de 12-putplaat met een milliliter media. Incubeer de lever plakjes onder normale weefsel kweekomstandigheden.

Gebruik indien mogelijk methoden om de zuurstofbeschikbaarheid van de weefselschijfjes te verbeteren. Op de dag na, verander de media met behulp van een handmatige pipet om verlies van weefsel door zuigkracht te voorkomen. De precisiegesneden leverplakjes zijn nu klaar voor experimenteel gebruik.

Voor onze toepassing hebben we de leversegmenten twee dagen met galzuren behandeld en gehomogeniseerd in lysebuffer voor messenger RNA-extractie en qPCR-analyse. Om de levensvatbaarheid van precisiegesneden leverplakjes na verloop van tijd te onderzoeken, gebruikten we ATP-niveaus als een proxy voor cel levensvatbaarheid. ATP-niveaus werden genormaliseerd tot eiwit, en werden gemeten op meerdere tijdstippen na de isolatie.

Atp niveaus werden verminderd in de onmiddellijke en een uur monsters, maar dit hersteld met drie uur. Hierna werden de ATP-niveaus gedurende vijf dagen gehandhaafd, hoewel ze in de loop van de tijd naar beneden trendden. H&E-kleuring werd gebruikt om precisiegesneden leverplakjes te onderzoeken die tot vijf dagen in de cultuur werden bewaard.

Weefselmorfologie was suggestief voor enige necrose die zich op dag twee voordeed, met ernstige necrose die op dag vijf plaatsvond. Vanwege de necrose die plaatsvindt tussen dag twee en vijf, raden we aan dat het experimentele nut van deze techniek beperkt is tot ongeveer drie dagen. Echter, Dit kan worden verbeterd door het gebruik van betere zuurstof levering technieken om het weefsel plakjes.

Precisie-gesneden lever plakjes lijken ook te hebben verdikking van collageen vezels ten opzichte van de tijd in de cultuur. Dit is suggestief voor spontane fibrogene processen die zich voordoen. In het voorbeeldexperiment werden de precisiegesneden leverplakjes twee dagen lang behandeld met drie afzonderlijke galzuren, om levercholestasis na te bootsen.

Kijkend naar de mRNA-expressie van drie cholangiocyten-specifieke genen, de twee geconjugeerde galzuren, glycocholic en taurocholic zuren, aanzienlijk toegenomen de expressie van zowel cytokeratine-19 en connexin-43. Dit komt overeen met de ontwikkeling van cholangiocyten. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe precisie gesneden lever plakjes te maken, en hoe basisweefsel cultuur uit te voeren.

Precisiegesneden leversegmenten kunnen worden gebruikt voor een zeer breed scala aan toepassingen, waaronder experimentele onderzoeken in RNA-expressie, eiwitexpressie, epigenetica, DNA-binding, metabolisme, infectiemechanismen, kankerinvasie, farmacologie, celbiologie en afscheidingsstudies, om er maar een paar te noemen.