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कृमि-संरेखित और Worm_CP, कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस से प्राप्त फ्लोरेसेंस इमेज डेटा के स्ट्रेटनिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए दो ओपन-सोर्स पाइपलाइन

हम यहां कृमि-संरेखित नाम के एक साधारण ओपनसोर्स फिजी-आधारित कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग कच्चे माइक्रोस्कोपी छवियों से ब्याज के सीधे कीड़े के एकल या बहु-चैनल असेंबल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। क्योंकि यह कार्यप्रवाह रुचि के उपयोगकर्ता चयनित जानवरों पर निर्भर करता है, यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब सी एलिगेंस से छवियों का विश्लेषण जहां कीड़े सभी सही चरण या हालत में नहीं हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्म-एलाइन के उत्पादन का उपयोग फिजी या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ्लोरेसेंस के बाद के मात्राकरण के लिए किया जा सकता है।

यहां हम सेलप्रोफिलर पाइपलाइन Worm_CP का उपयोग करके फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन प्रदर्शित करते हैं। बुंसेन बर्नर की लौ में एक पतली ग्लास केशिका का विस्तार करके एक मुंह माइक्रोपिपेट बनाकर शुरू करें। लौ में विस्तार के बाद, दो टुकड़ों में केशिका तोड़ अगर यह विस्तार के बाद दो टुकड़ों में नहीं तोड़ दिया ।

यदि यह दो टुकड़ों में टूट गया, सबसे लंबे समय तक एक के अंत में कटौती । लंबे टुकड़े का चयन करें और परीक्षण करें कि क्या केशिका पानी को एस्पिरेट करने का प्रयास करके खुला है। तीन मिलीमीटर सिलिकॉन ट्यूब से एडाप्टर को अलग करें।

कांच केशिका को छह मिलीमीटर सिलिकॉन ट्यूब से जुड़े एक केशिका एडाप्टर में प्लग करें। फिर छह मिलीमीटर ट्यूब के दूसरे छोर को 0.2 माइक्रोमीटर फिल्टर में और इसके दूसरे छोर पर तीन मिलीमीटर सिलिकॉन ट्यूब को प्लग करें। तरल को एस्पिरेट करने के लिए तीन मिलीमीटर सिलिकॉन ट्यूब के मुक्त अंत में एक मिलीमीटर फिल्टर टिप प्लग करें।

एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, मुंह माइक्रोपिपेट के साथ निश्चित कीड़े के एक गोली के आसपास जितना संभव हो उतना तरल निकालें। जल्दी से ट्यूब के नीचे बढ़ते माध्यम के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लास्टिक पिपेट टिप के किनारों से चिपके रहने से कीड़े को रोकने के लिए डिटर्जेंट के निशान के साथ पीबीएस में एक 10 माइक्रोलीटर टिप कुल्ला ।

फिर कैंची की एक जोड़ी के साथ टिप के बहुत अंत काट। पहले से तैयार एगर उठे पैड पर कीड़े के साथ बढ़ते माध्यम के आठ माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड को देखते हुए, कीड़े के ओवरलैप से बचने के लिए धीरे-धीरे इसे उत्तेजित करें।

फिर एगर उठे पैड पर बढ़ते माध्यम की बूंद को 18 बाय 18 मिलीमीटर कवरलिप के साथ कवर करें। जीवित कीड़े को माउंट करने के लिए, एक एग्राजिंग पैड पर एम 9 में भंग तीन मिलीमोलर लेविमिसोल के तीन से चार माइक्रोलीटर पिपेट करें। लेविसोल की बूंद में प्रति स्थिति 30 से 50 कीड़े चुनें।

फिर ड्रॉप को 18 बाय 18 मिलीमीटर कवरलिप के साथ कवर करें और एक घंटे के भीतर कीड़े को छवि दें। इमेजजे से ओपन सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर पैकेज फिजी स्थापित करें, या यदि यह पहले से ही कंप्यूटर पर स्थापित है, तो सत्यापित करें कि यह संस्करण 1.52A या बाद में है, फिर गिटहब से वर्म-रिलाइन भंडार डाउनलोड करें और इसे कंप्यूटर पर सहेजें। एक बार जब सभी पाइपलाइन घटकों को डाउनलोड और स्थापित किया गया है, तो फिजी खोलें और प्लगइन्स, मैक्रो पर क्लिक करके और मुख्य मेनू बार में चलाकर वर्म-संरेखित मैक्रो को निष्पादित करें।

कीड़ा-संरेखित का पता लगाएं। ijm स्क्रिप्ट और ओपन क्लिक करें। विश्लेषण किए जाने वाले चित्रों के साथ इनपुट फ़ोल्डर पर नेविगेट करें और चुनिंदा क्लिक करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि चयनित फ़ोल्डर में केवल छवि फ़ाइलें हैं।

मैक्रो स्वचालित रूप से एक आउटपुट फ़ोल्डर उत्पन्न करेगा जहां सभी परिणाम सहेजे जाएंगे। फोल्डर का नाम पोस्ट फिक्स के रूप में आउटपुट के साथ इनपुट फोल्डर जैसा ही होगा। मैक्रो को इनपुट फ़ोल्डर में पहली छवि खोलने की अनुमति दें और असेंबल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक सेटिंग्स निकालने के लिए एक प्रतिनिधि छवि के रूप में इसका उपयोग करें, जिसमें कीड़े की चौड़ाई, चमक और इसके विपरीत शामिल हैं।

सीधी रेखा ड्राइंग टूल का उपयोग करके, एक कीड़े की चौड़ाई में एक लाइन खींचें और ओके पर क्लिक करें। एकल कीड़े के लिए फसली क्षेत्रों की ऊंचाई निर्धारित करने के लिए इस लाइन की लंबाई का उपयोग करें। प्रत्येक चैनल के लिए, नाम, लुकअप टेबल निर्दिष्ट करें, और क्या इसे असेंबल में शामिल किया जाना चाहिए, फिर ओके पर क्लिक करें। इसके बाद, स्लाइडर्स का उपयोग करके चैनलों के लिए चमक और विपरीत सेटिंग्स को समायोजित करें। शेष चैनलों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।

एक बार जब सभी सेटिंग्स कॉन्फ़िगर कर ली जाती हैं, तो उन्हें सेटिंग टेबल में दर्ज किया जाएगा और आउटपुट फ़ोल्डर के सेलप्रोफिलर सबफोल्डर में सेव कर लिया जाएगा। सेटिंग्स के आवेदन के बाद सभी छवियों की तरह दिखेगा दिखाने के लिए एक छवि उत्पन्न होती है। यदि छवि संतोषजनक है, तो शीर्ष बॉक्स पर टिक करें।

चेक सभी सेटिंग्स पैनल का दूसरा और तीसरा बॉक्स असेंबल जनरेशन के विकल्प निर्दिष्ट करता है। दोनों बक्से टिक छोड़ दो और मैक्रो के बाकी निष्पादित करने के लिए ठीक क्लिक करें । टॉप बॉक्स पर टिक न करने से मैक्रो सेटअप को फिर से दौड़ना पड़ेगा ।

मैक्रो तो इनपुट फ़ोल्डर में सभी छवियों को खोलने के लिए आय । प्रत्येक छवि के लिए, खंडित या फ्रीहैंड लाइन टूल का उपयोग करके असेंबल में शामिल किए जाने वाले सभी कीड़े की देशांतर धुरी पर लाइनें खींचें। कीड़े की पूरी लंबाई के साथ सिर से पूंछ या इसके विपरीत लगातार लाइनें ड्रा करें और नियंत्रण T.एक बार सभी वांछित कीड़े को जोड़कर आरओआई प्रबंधक को प्रत्येक पंक्ति जोड़ें, ओके पर क्लिक करें। वर्म-संरेखित तब एकल चयनित कीड़े की फसली छवियां उत्पन्न करेगा, जो आउटपुट फ़ोल्डर के एकल कृमि उपफोल्डर में सहेजा जाएगा।

चयनित सभी कीड़े के असेंबल गठबंधन फ़ोल्डर में सहेजे जाएंगे। डाउनलोड करें और डाउनलोड पेज पर पिछले CellProfiler विज्ञप्ति के लिए लिंक पर क्लिक करके और आवश्यक ऑपरेटिंग सिस्टम का चयन करके CellProfiler 2.2.0 स्थापित करें। Worm_CP पाइपलाइन शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि सभी अपेक्षित आउटपुट छवियां वर्म-संरेखित आउटपुट फ़ोल्डर के सेलप्रोफिलर सबफोल्डर में मौजूद हैं।

मूल छवि की एक प्रसंस्कृत प्रति, कृमि आबादी का एक बाइनरी इमेज मास्क, यदि चयनित कीड़े पर रेखा खींची जाती है और मूल छवि में प्रत्येक चैनल का प्रतिनिधित्व करने वाली एक छवि मौजूद होनी चाहिए तो मुखौटा संरेखित करें। ओपन सेलप्रोफिलर, फिर छवियों इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और सेलप्रोफिलर मॉड्यूल फ़ोल्डर को खिड़की में खींचें जो यहां फ़ाइलों और फ़ोल्डर को छोड़ देता है। यदि पिछले विश्लेषण से छवियों की एक सूची मौजूद है, तो सबसे पहले विंडो में राइट-क्लिक करके और स्पष्ट फ़ाइल सूची का चयन करके इन्हें हटा दें।

मेटाडेटा इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और दूसरी निष्कर्षण विधि पर, पीले फ़ोल्डर पर क्लिक करें और वर्म-रिलाइन आउटपुट फ़ोल्डर के सेलप्रोफिलर सबफोल्डर पर नेविगेट करें। सेटिंग फाइल चुनें, फिर अपडेट पर क्लिक करें। इसके बाद, नाम और प्रकार इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि पाइपलाइन के लिए आवश्यक सभी छवियां मौजूद हैं।

पाइपलाइन चलाने से पहले, आउटपुट मॉड्यूल में आउटपुट परिणामों के लिए एक गंतव्य का चयन करें। परीक्षण मोड का उपयोग यह देखने के लिए करें कि पाइपलाइन स्टार्ट टेस्ट मोड पर क्लिक करके कैसे प्रदर्शन करती है और इसे फ़ोल्डर में पहली छवि के माध्यम से चलाने की अनुमति देती है। पाइपलाइन के प्रदर्शन से संतुष्ट होने पर, एग्जिट टेस्ट मोड पर क्लिक करें और छवियों का विश्लेषण करें।

विश्लेषण शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि विश्लेषण मॉड्यूल के सामने सभी आंखें बंद हैं। विश्लेषण पूरा होने पर, Worm_CP आउटपुट फ़ोल्डर खोलें जिसमें दो सीएसवी फाइलें, कीड़े सीएसवी और लाइनें सीएसवी शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि के अनुसार Culturing और इमेजिंग C.elegans कृमि आबादी की बड़ी सिंहावलोकन छवियों का उत्पादन करता है।

पाइपलाइन का उत्पादन काफी हद तक छवियों के शीर्ष पर खींची गई रेखाओं की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। कई लाइन उदाहरण और कीड़ा-संरेखित से उनके उत्पादन यहां दिखाए जाते हैं। कृमि-संरेखित लिपि का उपयोग करते समय, डेटा सबफोल्डर में पाए जाने वाले ओवरले छवियों के साथ-साथ असेंबल में व्यक्तिगत कीड़े के पैनलों से एक-दूसरे को काटने वाले कीड़े की दृश्य पहचान संभव है।

क्यूसी टेबल का उपयोग ओवरलैपिंग कीड़े की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, Worm_CP पाइपलाइन के लिए लाइनों को काटना समस्याग्रस्त है । इसका कारण यह है कि Worm_CP लाइन मास्क का उपयोग करता है, ब्याज के क्षेत्रों में नहीं, व्यक्तिगत कीड़े की पहचान करने में मदद करने के लिए ।

इसलिए, सेलप्रोफिलर कीड़े में से एक को दो वस्तुओं के रूप में खंडित करेगा। Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किए गए निश्चित जानवरों से फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया है जो लिपिड बूंदों में शामिल है। लिपिड बूंद सामग्री मैनुअल मात्राकरण का उपयोग कर जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती DBL1 जानवरों के बीच 17% की कमी आई है, और 12% से Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग कर ।

Worm_CP भी एक गर्मी सदमे मोहक जीन के नियंत्रण में GFP व्यक्त लाइव कीड़े में गर्मी सदमे प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । गर्मी के तनाव के अभाव में, कीड़े ने जीएफपी अभिव्यक्ति को प्रेरित नहीं किया। जब कीड़े एक छोटी गर्मी सदमे के रूप में उजागर कर रहे हैं, GFP अभिव्यक्ति प्रेरित है ।

Worm_CP का उत्पादन काफी हद तक उन लाइनों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है जो आप वर्म-संरेखित का उपयोग करके आकर्षित करते हैं। सुनिश्चित करें कि आपकी रेखाएं छू या ओवरलैपिंग नहीं कर रही हैं और एक ही दिशा में अपनी सभी रेखाओं को आकर्षित करें। क्यूसी टेबल की जांच करने से आपको उन लाइनों की पहचान करने में मदद मिल सकती है जो छू रही हैं या ओवरलैपिंग कर रही हैं ताकि आप अपने विश्लेषण से उन मामलों को बाहर कर सकें।

कृमि-संरेखण के उत्पादन का उपयोग फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेजों में बाद के परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है। हमने यहां एक बहुत ही बुनियादी सेलप्रोफिलर पाइपलाइन दिखाई है जिसमें अन्य विश्लेषण मॉड्यूल को बहुत आसानी से शामिल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, लिपिड बूंदों की संख्या गिनने के लिए या एक कीड़े के भीतर व्यक्तिगत बूंदों की तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए। इस तकनीक के लाभ में से एक व्यक्ति कीड़े से फ्लोरेसेंस को तेजी से निर्धारित करने की संभावना है।

हमारी प्रयोगशाला में, हम फ्लोरेसेंस रिपोर्टर्स का उपयोग कर व्यक्तिगत व्यवहार्यता में रुचि है और हम इस उद्देश्य के लिए नियमित रूप से कीड़ा संरेखित और Worm_CP का उपयोग करें ।