A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse
Chapters
Summary September 27th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.
Transcript
In deze video zullen we de culturing van de superieure cervicale ganglia van embryonale ratten demonstreren voor morfologische en proteomische analyse. Bereid de controle- en ontledingsmedia voor voordat u met de dissectie begint. Controlemedium bevat F-12 en lage glucose DMEM aangevuld met een insuline-selenium-transferrine mengsel, glutamine, zenuwgroeifactor, en BSA.
Dissectiemedium bevat L-15 aangevuld met pen-strep en BSA. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de media. Voorbereiding van platen voor het kweken van neuronen.
Verdun een milligram per milliliter voorraad poly-D-lysine tot 100 microgram per milliliter met steriel gedestilleerd water. Voor proteomische of genomische analyse, een tot twee dagen voor de dissectie, jas zes-put platen met ongeveer twee milliliter steriele 100 gram per milliliter van poly-D-lysine. Dit is nodig om te zorgen voor celhechting aan de put.
Wikkel de platen met plakfolie en bewaar de platen 's nachts op vier graden Celsius. Op de dag van de dissectie, vóór het begin van de dissectie, verwijder de poly-D-lysineoplossing uit de putten en spoel de putten vijf keer af met steriel gedestilleerd water, gevolgd door één keer met een lage glucose DMEM. Tijdens de enzymatische vertering van de ganglia, ongeveer een uur voor het platbeteren van de cellen, de DMEM van de platen aanzuigen en vervangen door 0,3 milliliter controlemedium.
Bewaar de platen op 35 graden Celsius onder 5%CO2 in een bevochtigde kamer. In de kap, het opzetten van de volgende items voor dissectie. Vier 50 milliliter steriele conische buizen met ongeveer 20 milliliter dissectiemedia in elke buis.
Vier steriele 35 millimeter schotels met 1,5 milliliter dissectiemedia. Een steriele 50 milliliter conische buis met 20 milliliter dissectie media voor centrifugatie. Een 15 milliliter steriele conische buis voor het centrifugeren van de ganglia, een steriele 10 milliliter buis voor het verzamelen van de gescheiden cellen.
Gebruik een droge kralen sterilisator om een paar fijne tangen steriliseren voor ten minste een minuut. Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College of California zijn ontwikkeld op basis van richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes for Health.
Verwijdering van E21 embryo's van de zwangere rat. Merk op dat het verwijderen van de baarmoeder hoorn kan worden uitgevoerd buiten de kap als de omgeving grondig wordt gesteriliseerd. Euthanaseer een zwangere rat met CO2-inademing.
Schuif de vacht uit de buikstreek en veeg de huid in het gebied af met 70% alcohol om het te steriliseren. Met behulp van een verse set steriele scharen en tangen, snijd door de huid en vervolgens de spier om de baarmoeder hoorns met de embryo's bloot te stellen. Verwijder de baarmoederhoorn met de embryo's, met behulp van een nieuwe set schaar en tangen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de darmen in het proces niet worden beschadigd.
Breng de baarmoederhoorn met de embryo's in 150 millimeter steriele petrischaal en breng ze over in de kap. Verwijder met behulp van een nieuwe set tangen en scharen de embryo's uit de baarmoederhoorn en scheid de embryo's van de vruchtwatermembranen en de placenta. Om de embryo's te euthanaseren, snijd het ruggenmerg van de embryo's langs de middellijn onder de rechterarm.
Dit vermindert het bloeden van de halsslagader tijdens het verwijderen van de SCG. Breng deze embryo's over in de bereide 50 milliliter conische buizen met dissectiemedia. Zorg ervoor dat de embryo's in de media worden ondergedompeld.
Elke buis kan maximaal drie embryo's bevatten. Isolatie van het superieure cervicale ganglion van het embryo. Breng een pup van de dissectiemedia over op een steriele petrischaal van 150 millimeter half gevuld met massief substraat met zijn dorsale oppervlak op het substraat.
Met behulp van drie steriele 23 meter naalden, pin de pub aan de schotel met een naald onder elke arm en een derde naald door de mond om zorgvuldig hyperextend de nek. Snijd door de huid in het nekgebied met behulp van steriele fijne tangen om de speekselklieren eronder bloot te leggen. Verwijder deze klieren met behulp van fijne tangen.
Zoek de sternocleidomastoïde en omohyoïde spieren in de buurt van respectievelijk het sleutelbeen en de luchtpijp. Snijd eerst de dwarse sternocleidomastoïde spieren door. En snijd vervolgens voorzichtig de dunne omohyoïde spier met fijne tangen.
Zodra deze spieren zijn verwijderd, zal de splitsing in de halsslagader aan het voorste uiteinde zichtbaar zijn aan weerszijden van de luchtpijp met de SCG onder deze vork in de halsslagader. Til met gesloten tangen voorzichtig de halsslagader op om de SCG te visualiseren. Met behulp van een tang aan weerszijden van de SCG, trek de halsslagader en breng het naar de bereide steriele 35 millimeter gerechten.
Dit weefsel zal waarschijnlijk bevatten de SCG met de halsslagader, de nervus vagus met de nodose ganglia, evenals andere segmenten van spier of vet in het gebied. Herhaal het dissectieproces aan de andere kant. Verwijder SGT's uit alle embryo's voordat u verdergaat met de resterende beschreven dissectiestappen.
Verdeel de geïsoleerde weefsels over twee van de 35 millimeter schotels om de verwerking van de weefselmonsters te vergemakkelijken. Nabewerking van de SCG. Om de SCG te scheiden van het ontleed weefsel, eerst gebruik maken van fijne tangen om eventuele vreemde weefsels te verwijderen, zoals spier of vet, het verzorgen van het gebied in de buurt van de halsslagader te vermijden.
Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zijn twee ganglia zichtbaar. De nodose ganglion is kleiner en cirkelvormig, terwijl de SCG amandelvormig is. Trek voorzichtig aan de nervus vagus om de nervus vagus en de nodose ganglia van de halsslagader te scheiden en vervolgens de SCG te scheiden van de halsslagader.
Gebruik fijne tangen om de capsule die SCG omringt te verwijderen. Breng de SCG over op een nieuw 35 millimeter kweekschotel. Herhaal dit proces met alle ontleed weefselmonsters.
Bedek een gesteriliseerde, met katoen aangesloten glazen pipet met ontledingsmedia om te voorkomen dat het weefsel zich aan de pipetwanden vastkleven. Gebruik de pipet om de dissectiemedia te vervangen door steriele twee milliliter collagenase type II, dispase type II in calcium- en magnesiumvrije HBSS en 50 minuten uit te broeden bij 37 graden Celsius om de weefsels af te breken. Houd er rekening mee dat de incubatietijden mogelijk moeten worden geoptimaliseerd met verschillende batches collagenase/dispase en meestal varieert van 40 minuten tot een uur.
Breng na de incubatie de SGT's en collagenase/dispase over naar een steriele conische buis van 15 milliliter. Gebruik de dissectiemedia om de platen te spoelen en de oplossing over te brengen naar de buis. Voeg voldoende dissectiemedia toe om het volume op ongeveer 10 milliliter te brengen.
Centrifuge bij 200 x g, 1.000 tot 1, 200 tpm gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het monster te pelleteren. Aspirate de supernatant, het verzorgen van niet verjagen van de pellet. Resuspend de pellet met 10 milliliter dissectie media, herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant.
Vervang door een tot twee milliliter cultuurmedium. Met behulp van een smal-bore, gebogen-tip steriele Pasteur pipet, pre-coat het met cultuur medium, mechanisch scheiden van de klonten door zachtjes triturating vijf tot zes keer. Laat de grotere klonten genoegen nemen met ongeveer een minuut en breng de supernatant celsuspensie over naar een nieuwe 10 milliliter buis.
Herhaal dit proces nog drie keer met toenemende kracht van trituratie elke keer om te zorgen voor bijna volledige dissociatie van de SCGs. Breng de supernatant na elke ronde van trituratie naar de 10 milliliter buis met de supernatant van de eerste trituratie. Voeg genoeg cultuurmedia toe om het volume op acht tot 10 milliliter te brengen.
Meng voorzichtig een celsuspensie en kwantificeer de celdichtheid met een hemocytometer. Verdeel de celsuspensie in de putten bij de aangewezen celdichtheid voor de experimenten. Meng de celsuspensie voortdurend tijdens het beplatingsproces om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.
Voor morfologische analyse, plaat de cellen rond 8,000 cellen per put in een 24-put plaat. En voor genomische en proteomische protocollen, plaat de cellen zo hoog als 30,000 cellen per put. Breng de platen over op een glazen desiccator met steriel water aan de onderkant om een bevochtigde kamer te creëren.
Injecteer voldoende CO2, ongeveer 120 milliliter, om een 5%CO2-omgeving in de desiccator te verkrijgen, voorafgaand aan het afdichten. Houd de platen op 35,5 graden Celsius. Dit wordt in het protocol dag nul genoemd.
Deze platen kunnen ook worden onderhouden in een reguliere 5%CO2 incubator. De hierboven beschreven methode minimaliseert temperatuur- en pH-veranderingen en helpt ook kruisbesmetting te voorkomen. Onderhoud van de gekweekte SCG neuronen en behandelingen.
Deze foto's tonen de gescheiden superieure cervicale ganglia cellen op dag nul, dag een, en dag vijf. De dag nul beeld toont de cellen bij beplating. De cellen verguld op dag nul bevatten een mengsel van zowel neuronale als niet-neuronale cellen.
Op dag een, 24 uur na beplating, voorzichtig verwijderen van de helft van de cultuur media en vervangen door twee micromolar Ara-C, cytosine D-arabinofuranoside, een anti-mitotische agent. Laat de behandeling 48 uur op de cellen staan. Meestal is deze lengte van de behandeling voldoende om niet-neuronale cellen in de cultuur te elimineren.
Op dag drie, zachtjes aspirate de helft van het medium en vervangen door controlemedium. Op dag vier zijn de cellen klaar voor experimentele behandelingen. Voer culturen om de andere dag met het juiste medium.
Voorzichtig vervangen van de helft van het medium in de put met vers medium. Het beeld op dag vijf laat een grote axonale groei zien zonder dendritische groei. Om dendritische groei te induceren, kunnen neuronen worden gekweekt op Matrigel of worden behandeld met 10% serum of 50 nanogram per milliliter botmorfogenetisch eiwit-7.
Figuur twee toont veranderingen in neuronale morfologie van E21 rat SCG neuronen na behandeling met BMP-7. Representatieve fase contrastmicrografen bij 10 X vergroting tonen de cirkelvormige neuronale cel lichaam met axonen in de controle neuronen in paneel A, en neuronen met meerdere korte denddrite-achtige processen wanneer behandeld met BMP-7 aangetoond door de pijlen in paneel B.Gekweekt SCG neuronen na passende behandelingen kunnen worden gebruikt voor morfologische analyse met behulp van immunocytochemische vlekken voor genomische analyse en voor biochemische studies , zoals voor proteomische analyses. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor immunostaining en monstervoorbereiding voor proteomische analyse.
Figuur drie toont immunostaining van MAP-2 eiwit in gekweekte embryonale ratten sympathische neuronen. Panelen A tot en met D tonen gekweekte SCG-neuronen behandeld met controlemedia en panelen E via H tonen neuronen behandeld met BMP-7 met 50 nanogram per milliliter gedurende vijf dagen. Representatieve micrografen die immunocytochemische kleuring van de neuronen met microtubuli geassocieerde eiwit-2 in C en G tonen, een nucleaire vlek in D en H met fase contrast micrografen in B en F, en ontstaan van de drie kanalen in A en D.Immunocytochemische kleuring van microtubuli geassocieerde eiwit-2 is aanwezig in het cellichaam en proximale axoons van de controle neuronen in paneel C.And kleuring van MAP-2 eiwit in het cellichaam , en dendrieten in BMP-7 behandelde neuronen is in paneel G.Hier is een monster run van superieure cervicale ganglia behandeld met controle media, die 1, 100 eiwitten gedetecteerd.
Gen ontologie met behulp van de Panther database bleek dat de meeste van de eiwitten waren cytoplasmatisch. Er waren echter membraangebonden eiwitten en eiwitten op cellulaire knooppunten in het monster. Deze analyse toonde ook aan dat eiwitten die betrokken zijn bij een breed scala van neuronale signalering trajecten werden gedetecteerd in het monster.
Tot slot, na het bekijken van deze video, moet je in staat zijn om te isoleren en cultuur rat embryonale superieure cervicale ganglion neuronen voor morfologische en proteomische analyse. Dit werk werd gefinancierd door het facultaire ontwikkelingsfonds en het zomeronderzoeksprogramma van Saint Mary's College of California.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
