Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete Huntiella omanensis
Chapters
Summary June 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet är en lättanvänd genomredigerare som har använts i modell- och icke-modellarter. Här presenterar vi en proteinbaserad version av detta system som användes för att införa en tidig stopp kodon i en parning gen av en icke-modell fintrådiga ascomycete svamp.
Transcript
Vårt protokoll är viktigt eftersom det tillåter forskare som arbetar med icke-modell svampar möjlighet att etablera banbrytande genomredigeringsteknik i sina laboratorier. Eftersom det inte är beroende av befintliga tekniker, såsom uttryckssystem, har detta protokoll fördelen att vara lättare att etablera i icke-modellsystem. Denna metod kan användas över olika svamparter och kan användas för att belysa funktioner av gener som är involverade i väg parning, tillväxt och patogenicitet.
Så när du utför denna procedur, måste man vara säker på att ha tillräckligt med på varandra följande dagar för att konkurrera protokollet eftersom det bara finns några punkter i experimentet där det kan pausas. För att skörda conidian, filtrera den flytande kulturen genom ett lager av steril laboratorieduk i 50 milliliter centrifugerör för centrifugering. Resuspend conidia pelleten i fem milliliter vatten och visa en 10 microliter aliquot av conidia lösningen under ett ljusmikroskop vid en 40X förstoring för att bekräfta att endast conidia har återvunnits.
Därefter tillsätt 200 milliliter färsk 1%maltextrakt buljong till en 500 milliliter kolv och överför hela volymen av conidia till kolven. Sedan inkubera den flytande kulturen i upp till 12 timmar i en 25 graders Celsius skakinsk inkubator på 120 varv per minut. För att skörda germlingarna, överför kulturen till 50 milliliter centrifugeringsrör för centrifugering och resuspend germlingarna i upp till 10 milliliter av en molar sorbitol.
Tillsätt en milliliter germling-lösning till olika koncentrationer av enzymlösning och inkubera sporenzymlösningen i två till tre timmar i skakinkubatorn vid 80 varv per minut. För att skörda protoplasterna, filtrera enzymlösningen genom ett lager av steril laboratorieduk och samla in protoplasterna genom centrifugering. Sedan försiktigt återanvända protoplast pelleten i 200 mikroliter av STC buffert och kontrollera en 10 mikroliter alikvot av lösningen under ett mikroskop för att bekräfta att endast protoplaster har återvunnits.
För att börja omvandlingen, kombinera ungefär fem gånger 10 till de sex protoplasterna med en enda volym av ribonukleoproteinlösning och cirka sex mikrogram av givarens DNA-fragment. Därefter använder en pipett för att sakta och jämnt droppa en milliliter nyberedda 30%PTC lösning på protoplast suspensionen för att skapa ett hydrofoba lager över protoplasterna och inkubera lösningen i 20 minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tillsätt fem milliliter osmotisk kontrollmedium till protoplast suspension, pipettering långsamt och försiktigt för att noggrant blanda lösningen.
Efter blandning inkubera protoplastlösningen i skakinkubatorn med 80 varv per minut över natten. Nästa morgon, dela lösningen mellan fem 60 millimeters kulturplattor. Tillsätt 10 milliliter osmotisk kontroll medelagar kompletterad med 30 mikrogram per milliliter Hygromycin B till varje platta och rotera långsamt varje platta för att blanda.
Låt det första lagret av agar ställa in innan du lägger till 10 milliliter osmotisk kontroll medelstorgar kompletterad med 40 mikrogram per milliliter Hygromycin B två varje platta. Efter att det andra lagret av agar att ställa in, inkubera kulturerna vid 25 grader Celsius tills enstaka isolat kan observeras växer genom båda skikten av agar. För att återvinna de framgångsrikt omvandlade isolaten, överför de individuella tillväxt-kapabla isolaten till färska maltextrakt agar plattor kompletteras med 50 mikrogram per milliliter av Hygromycin B.To bedöma effekterna av den riktade genen störningar på heterothallic kapacitet svampen, co-inokulera färska maltextrakt agar medium med en mutant stam samt en stam av motsatt parningstyp.
Vid arbete med H.omanensis, täck men täta inte plattorna. Placera plattorna i rumstemperatur i sju dagar. Vid slutet av inkubationen, visuellt bedöma för produktion av sexuella strukturer.
För att testa homothallic-kapaciteten hos den muterade stammen, inokulera färskt maltextrakt agar medium med den muterade stammen av intresse och inkubera plattan vid rumstemperatur i en vecka som visats. För att bedöma effekterna av störningen på tillväxttakten hos svampen som studeras, sätt in baksidan av en stor steril pipettspets i de aktivt växande kanterna på kulturen hos varje mutant och vildtypsstam av intresse för att skapa mycelialtäckta agarproppar och inokulera färskt maltextraktagarmedium. Minst tre replikat bör göras per kulturtyp.
Efter tre dagars tillväxt vid 20 grader Celsius, mäta tillväxten i varje platta på två vinkelräta diametrar. Conidia används som utgångsmaterial för protokollet får gro och växa tills de blir unga germlings. Observera att mogna mycelial strängar som dessa är för mogna för nedbrytning och bör inte användas.
När cellerna inte längre har cellväggar blir de mycket känsliga för mekaniska störningar och släpper runda protoplaster som kan skördas för omvandling. Framgången för protokollet kan bekräftas på en fenotypisk analys av mutantstammarna. För denna mutant MAT 127 isolatet, vegetative radiella tillväxttakten minskades avsevärt, vilket tyder på en pleiotropic effekt för den nya parning genen.
Vidare var mutantisovan oförmögen att slutföra en sexuell cykel som producerar endast omogna sexuella strukturer som inte gav upphov till sexuella sporer jämfört med den vilda-typ isolat som avslutade hela sexuella cykeln inom några dagar efter inkubation. RNA är mycket känslig och försämras mycket lätt. Därför är en ren arbetsmiljö och att arbeta snabbt på is både avgörande för att detta experiment ska lyckas.
När mutanta isolat har genererats framgångsrikt, kan de utsättas för fenotypiska eller RNA-seq analys som lämpligt för den gen som kännetecknas.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
