Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Studera aktiviteten hos Neuropeptider och andra tillsynsmyndigheter i utsöndringssystemet hos den vuxna myggan
Chapters
Summary August 24th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver metoder bakom Ramsay-analysen, jonselektiva mikroelektroder, scanning jonselektiv elektrodteknik (SIET) och in vitro-kontraktionsanalyser, som tillämpas för att studera det vuxna myggutsöndringssystemet, bestående av malpighiska tubuler och hindgut, för att kollektivt mäta jon- och vätskeutsöndringshastigheter, kontraktil aktivitet och transepithelial jontransport.
Transcript
Detta protokoll beskriver tekniker som kan användas av smådjur fysiologer för att klargöra rollen av neuropeptider och andra hormonella faktorer som reglerar matsmältningssystemet och eller utsöndringssystemet. Dessa tekniker möjliggör mätningar av biologiska prover av mikrostorlek som annars inte skulle vara möjliga med hjälp av tekniker som utformats speciellt för större djurmodeller, till exempel gnagare och teleus. Denna metod kan ge insikt i tarmens endokrina reglering, inklusive transport av epitelial, liksom glatta muskler associerade med mag-tarmkanalen i insekter och i liknande storlek icke-insektsarter.
Farwa Sajadi, doktorand från mitt laboratorium, demonstrerar insektsrenalrörsprocedurerna. Dessutom kommer en före detta doktorand från mitt labb Aryan Lajevardi att demonstrera de hindgutfokuserade protokollen. Börja med att förbereda Ramsay och sammandragningsanalyser för experimenten.
Använd pipetter och fyll brunnar med upp till 20 mikroliter lösning. För ostimulerade kontroller, fyll brunnarna med 20 mikroliter av Aedes saltlösning Schneiders medium. När alla brunnar är fyllda, häll hydratiserad mineralolja i analysrätten tills brunnarna och Minutien-stiften är nedsänkta.
Efter nedsänkning av tubule i brunnen, plocka upp den proximala änden av tubule med tång, ta bort den från baddroppen och linda änden runt stiftet. Linda tubule runt stiftet två gånger och håll längden på tubule kvar i baddroppen överensstämmer med de andra tubules. För att göra en natriumselektiv mikroelektrod, använd en en milliliter spruta för att fylla elektroden med 100 millimolar natriumklorid.
Se till att återfyllningslösningen fylls tills elektrodens spets. Om luftbubblor uppstår, snärta försiktigt mikroelektroden eller ta bort lösningen och fyll på. Doppa en 10 mikroliter pipettspets i den natriumselektiva jonoforlösningen.
Rada upp elektroden vinkelrätt mot pipetten, placera sedan ett handske finger över botten av spetsen för att skapa tryck och utvisa en liten droppe jonofor. Rör försiktigt jonoforen till mikroelektrodspetsen och se till att inte bryta den. Fyll en liten bägare halvvägs med 100 millimolar natriumklorid och placera lite modelleringslera på insidan högst upp på bägaren.
När jonoforen har tagits upp, placera elektrodspetsen ner på bägarens vägg och låt spetsarna i natriumkloriden. Håll ISME i bägaren tills den är klar att användas. För att göra ISME-referenselektroden, fyll i en elektrod med 500 millimolar kaliumklorid och förvara den i en bägare.
Täck elektrodspetsarna med en lösning på cirka 3,5% polyvinylklorid, upplöst i tetrahydrofuran, för att undvika förskjutning av jonoforen när den är nedsänkt i paraffinolja. För att kalibrera natriumelektroden, placera 10 mikroliter droppar natriumkloridstandardkoncentrationer på kanten av Ramsey-skålen med de inkuberade malpighiska tubulerna. Placera standarddropparna två centimeter ifrån varandra med den högre koncentrationen ovanpå.
För in både referenselektroden och jonelektiv elektrod över kloridsilvertrådarna och fäst dem säkert med hjälp av elektrodhållare som är fästa vid mikromanipulatorer. Navigera båda elektroderna mot den 200 millimolära natriumkloriddropleten med hjälp av mikromanipulatorerna, så att elektrospetsarna inte vidrör botten av skålen. Slå på elektrometern för att börja spela in och låt avläsningen stabiliseras.
Spela in läsningen och fortsätt till nästa standard. Efter att ha förvärvat mätningar av vätskesekreationen, flytta försiktigt referens- och jonselektiva elektroder till den utsöndrade droppen med hjälp av mikromanipulatörerna. Slå på inspelningen och låt avläsningen stabiliseras och spela sedan in.
Slå på IPA-2 Jon/Polarografisk förstärkare, ljusmikroskopet och datorerna. Placera natriumselektiv mikroelektrod på en hållare som består av en silverkloridtråd och fäst den i honkontaktuttaget. Ta bort en referenselektrod från bägaren med kaliumkloriden, placera ett finger i ena änden och luta glaskapillären mot detta finger för att förhindra att agaren faller ut.
Placera försiktigt ena änden i hållaren och se till att inga bubblor bildas. Om det finns en bubbla, ta bort referenselektroden, fyll på hållaren med tre molar kaliumklorid och upprepa. Placera elektrodhållaren i honkontaktuttaget.
Efter kalibrering dissekerar du organet. Placera poly-L-lysinformen med det dissekerade provet på mikroskopstadiet och sätt in spetsen på referenselektroden inuti saltlinjen. Sänk ner spetsen på jonselektiv mikroelektrod i saltlinjen och var försiktig så att du inte bryter spetsen.
Använd de manuella justeringsknapparna för att justera mikroelektrodpositionen medan du tittar under ljusmikroskopet. Justera mikroelektrodens vertikala position så att spetsen är på samma plan som organet eller vävnaden och vrid sedan motoromkopplaren för att aktivera. Använd datorpiltangenterna och flytta mikroelektroden horisontellt till en position tre millimeter från vävnaden för att mäta bakgrundsinspelningar.
När du är klar, börja spela in genom att trycka på F5, få fem mätningar av bakgrundsaktiviteten. Flytta mikroelektrodspetsen nära vävnaden och var försiktig och var försiktig och genomborra inte organet. Minska nyckelträffkänsligheten för att placera mikroelektrodspetsen två mikrometer direkt till höger, vinkelrätt mot vävnaden.
Skaffa tre inspelningar på plats längs rektalplattan för att identifiera platsen för den största jonaktiviteten och få sedan baslinjemätningar av koksaltlösning på den plats som visar störst aktivitet. För att spela in hindgutkontraktioner, fyll en av brunnarna i skålen med en känd volym Aedes saltlösning. Efter dissekering överför du försiktigt den dissekerade bakguten fäst vid mitten av tarmen till en brunn i en annan maträtt och se till att inte nypa ileum.
Sänk ner tarmen i saltlösning inuti brunnen och placera Minutien-stift i mitten av tarmen och ändtarmen. Ileum bör inte vara under spänning och spontana sammandragningar med ursprung vid pyloriska ventilen vid det främre ileum bör observeras. Anslut videokameran till det stereoskopiska mikroskopet.
Placera sedan skålen som innehåller det dissekerade organet under mikroskopet och spela in en video i två minuter. Tillämpning av DH31 mot ostimulerade Malpighian tubules resulterar i en betydande ökning av vätskor utsöndringshastighet, bekräftar dess roll som ett diuretiskt hormon i Aedes myggor. När tubuler behandlas med AedaeCAPA-1 observeras en minskning av utsöndringshastigheten i DH31 stimulerade malpighiska tubules.
Jon selektiva elektroder användes för att mäta natriumkoncentrationer i de utsöndrade dropparna. Behandling av DH31 på MTs hade ingen effekt på natriumkoncentrationen i den utsöndrade droppen. Med tillämpning av AedaeCAPA-1 ökades natriumkoncentrationen i den utsöndrade vätskan dock avsevärt.
Dessutom, jämfört med ostimulerade kontroller, DH31 ledde till en betydligt högre natrium transport hastighet, medan AedaeCAPA-1 avskaffade denna ökning av DH31 stimulerade tubules. SIET användes för att bedöma förändringar i natriumtransport längs rektal pad epitelial av vuxna kvinnliga myggor. En leucokinin analog användes för att undersöka förändringar i natrium absorption, vilket resulterade i en fyrfaldig minskning av natrium absorption jämfört med saltlösning kontroll.
För att bedöma rollen av en neuropeptide pyrokinin2 på ileal motility, en Rhodnius prolixus analog användes, som tidigare visat sig aktivera A.aegypti PK2 receptorn berikad i myggan ileum. I förhållande till utgångsnivåerna hämmar PK2 signifikant ileala sammandragningar. När du utför en Ramsay-analys med malpighiska tubuler och mäter jon- eller vätskeutsöndringshastigheter är det absolut nödvändigt att tubuler inte skadas under dissekering eller under överföringen till analys skålen.
Efter Ramsay-analysen kan specifika membrantransportörer riktas antingen farmakologiskt eller molekylärt med hjälp av omvänd genetisk teknik för att urskilja deras specifika bidrag till transepithelial transport av löstor i det enkla epitelet.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
