Studera aktiviteten hos Neuropeptider och andra tillsynsmyndigheter i utsöndringssystemet hos den vuxna myggan

Summary

Detta protokoll beskriver metoder bakom Ramsay-analysen, jonselektiva mikroelektroder, scanning jonselektiv elektrodteknik (SIET) och in vitro-kontraktionsanalyser, som tillämpas för att studera det vuxna myggutsöndringssystemet, bestående av malpighiska tubuler och hindgut, för att kollektivt mäta jon- och vätskeutsöndringshastigheter, kontraktil aktivitet och transepithelial jontransport.

Abstract

Studier av insektsfysiologi, särskilt i de arter som är vektorer av patogener som orsakar sjukdom hos människor och andra ryggradsdjur, ger grunden för att utveckla nya strategier för skadedjursbekämpning. Här beskrivs en serie metoder som rutinmässigt används för att bestämma de funktionella rollerna för neuropeptider och andra neuronala faktorer (dvs. biogena aminer) på myggans utsöndringssystem, Aedes aegypti. Malpighian tubules (MTs), som ansvarar för primär urinbildning, kan fortsätta att fungera i timmar när de avlägsnas från myggan, vilket möjliggör vätskeutsöndringsmätningar efter hormonbehandlingar. Ramsay-analysen är därför en användbar teknik för att mäta utsöndringshastigheter från isolerade MTs. Jonselektiva mikroelektroder (ISME) kan sekventiellt användas för att mäta jonkoncentrationer (dvs. Na⁺ och K⁺) i den utsöndrade vätskan. Denna analys möjliggör mätning av flera MTs vid en given tidpunkt, bestämma effekterna av olika hormoner och läkemedel. Scanning jonselektiv elektrodteknik använder ISME för att mäta spännings representativ för jonisk aktivitet i det oförändrat skiktet intill ytan av jontransportande organ för att bestämma transepithelial transport av joner i nära realtid. Denna metod kan användas för att förstå rollen av hormoner och andra regulatorer på jonabsorption eller utsöndring över epitel. Hindgut kontraktionsanalyser är också ett användbart verktyg för att karakterisera myoaktiva neuropeptider, som kan förbättra eller minska detta organs förmåga att ta bort överskott av vätska och avfall. Sammantaget ger dessa metoder insikt i hur utsöndringssystemet regleras hos vuxna myggor. Detta är viktigt eftersom funktionell samordning av utsöndringsorganen är avgörande för att övervinna utmaningar som uttorkning stress efter eklosion och innan du hittar en lämplig ryggradsdjur värd för att få ett blodsocker.

Introduction

Underhåll av salt- och vattennivåer i insekter gör det möjligt för dem att lyckas i många ekologiska och miljömässiga nischer, med hjälp av en mängd olika ^{utfodringsstrategier1}. De flesta insekter har utvecklat mekanismer för att reglera sammansättningen av sin hemolymf inom snäva gränser för att motstå de olika utmaningarna i samband med deras speciella ^miljö2. Terrestra insekter står ofta inför utmaningen att bevara vatten och utsöndringssystemet genomgår anti-diuresis för att förhindra förlust av vatten och vissa väsentliga salter, vilket undviker uttorkning. Däremot uppstår diures när insekten matar och utmanas med överskott av vatten och potentiellt ^salter3,4. Genom sitt specialiserade och mycket aktiva utsöndringssystem har insekter utvecklat regleringsmekanismer som verkar för att motverka deras osmoregulatoriska utmaningar. Hos vuxna Aedes aegypti myggor består utsöndringssystemet av malpighiska tubuler (MTs) och hindgut, varav den senare består av det främre ileum och bakre ändtarmen5. MTs är ansvariga för att generera primär urin, vanligtvis rik på NaCl och/eller KCl. Den primära urinen modifieras sedan genom sekretoriska och reabsorptive processer när den färdas nedströms tubule och går in i bakgut5. Den slutliga utsöndring kan vara hyper- eller hypoosmotisk för hemolymfen, beroende på utfodring/ miljöförhållanden, och berikas i giftigt och kvävehaltigt ^avfall2.

MTs är idealiska för att studera många funktioner i epitelvätska och lösningstransport eftersom de utför ett stort utbud av transport- och utsöndringsfunktioner2,6. Genom hormonell ^reglering2 fungerar MTs genom att utsöndra joner och andra lösgöringar från blodet till tubule ^lumen7, vilket ger en osmotisk gradient som gör det möjligt att transportera vatten med aquaporins8,9, vilket tillsammans skapar den primära urinen, innan den reser mot den reabsorptive hindgut2. Således, genom att samla den utsöndrade vätskan från isolerade MTs, kan man kontinuerligt övervaka transepithelial transport av vätska och joner. Mätning av utsöndringshastighet och urinsammansättning ger insikt om mekanismer som ansvarar för transepithelial jon och vätsketransport. En populär metod för att studera vätskeutsöndringshastigheter är Ramsay-analysen, som först introducerades av Ramsay ¹⁹⁵³¹⁰. I denna metod behandlas tubuleens distala (slutna) ände med ett hormon (eller annan testförening/läkemedel), medan den proximala (öppna) änden lindas runt en stift i vattenmättad paraffinolja, som utsöndrar den primära urinen och ackumuleras som en droppe på stiftspetsen. Isolerade MTs kan överleva och fungera under långa perioder (upp till 24 h) under optimerade in vitro-förhållanden, vilket gör dem lämpliga och effektiva modeller för vätskeutsöndringsmätning. Insekter har öppna cirkulationssystem, så MTs dissekeras lätt och avlägsnas eftersom de vanligtvis flyter fritt i hemolymph6. Dessutom, med undantag för bladlöss – som saknar ^MTs11 – kan antalet MTs i en viss insektsart variera avsevärt från fyra till hundratals (fem i Aedes myggor) vilket möjliggör flera mätningar från en insekt.

MTs i Aedes myggor, i likhet med andra endopterygote insekter, består av två celltyper som bildar ett enkelt epitel2,12; stora huvudceller, som underlättar aktiv transport av katjoner (dvs. Na⁺ och K⁺) till lumen, och tunna stellatceller, vilket hjälper till vid transepithelial Cl-utsöndring13. MTs är inte innervated2, och regleras istället av flera hormoner inklusive både diuretiska och anti-diuretiska faktorer, vilket möjliggör kontroll av jontransport (främst Na ⁺, K⁺, och Cl^–) och osmotiskt skyldigt ^vatten2. Många studier har undersökt hormonella regleringen av Aedes MTs för att förstå betydelsen av endokrina faktorer på transepithelial transport14,15,16,17,18. Som framgår av de representativa resultaten visar protokollen häri effekterna av olika hormonella faktorer på isolerade MTs från vuxna kvinnliga A. aegypti myggor, inklusive både diuretisk och anti-diuretisk kontroll (figur 1). Ramsay-analysen används för att visa hur ett anti-diuretiskt hormon, AedaeCAPA-1, hämmar vätskeutsöndring av MTs stimuleras av diuretiskt hormon 31 (_DH31) (figur 1).

Den mindre storleken på insekter har krävt utveckling av mikrometoder för att mäta jonisk aktivitet och koncentrationer i vätskeprover, eller nära ytan av isolerade vävnader som MTs och tarm. Olika metoder har implementerats, inklusive användning av radioisotoper av ^joner19, vilket kräver insamling av de utsöndrade vätskedropparna för mätning av jonkoncentrationer20. Stimulerade Aedes tubules in vitro utsöndrar vanligtvis ~ 0,5 nL / ^min21, vilket innebär att hantering av sådana små volymer kan utgöra en utmaning och potentiellt införa fel vid överföring. Till följd av detta har jonselektiva mikroelektroder (ISMEs) använts i stor utsträckning för att mäta jonkoncentrationer i utsöndrade droppar av MTs in vitro. I denna metod placeras en referenselektrod och ISME, fylld med lämplig återfyllningslösning och jonofor, i den utsöndrade urindroppen för att bestämma ^{jonkoncentrationer22}. Anpassat från Donini och ^kollegor23, använder detta nuvarande protokoll en Na ⁺ selektiv jonofor för att mäta jonaktivitet i utsöndrade droppar från stimulerade MTs hos vuxna Aedes myggor. Eftersom jonselektiva mikroelektroder mäter jonaktivitet kan dessa data uttryckas som jonkoncentrationer efter antagandet att kalibreringslösningarna och försöksproverna har samma ^{jonaktivitetskoefficient21} (figur 1B,C).

Scanning Jonselektiv elektrodteknik (SIET) använder också ISMEs för att mäta jonkoncentrationsgradienter i det ofeldade skiktet intill organ, vävnader eller celler som transporterar joner. ISMEs mäter spänningsgradienter som sedan kan användas för att beräkna jonkoncentrationens gradienter och jonflödets riktning och storlek över organet, vävnaden eller ^cellen20. I denna teknik är ISME monterad på en manipulator med tre axlar som styrs av datoriserade mikrostegmotorer så att dess 3D-position styrs till ^{mikrometernivån20}. Spänningar mäts på två punkter i det oförtred skiktet med hjälp av ett provtagningsprotokoll som är programmerat till och styrt av datorprogramvara. De två punkterna separeras vanligtvis med ett avstånd på 20–100 μm med en punkt inom 5–10 μm från ytan på organet, vävnaden eller cellen och den andra punkten ytterligare 20–100 μm bort. Skillnaden i spänningsstorlek mellan de två punkterna beräknas för att erhålla en spänningsgradient24,25,26, som sedan används för att beräkna koncentrationsgradienten och därefter nettoflödet med ficks ^lag24,27. Denna metod är användbar för att bedöma transport av specifika joner över olika regioner i insektsmagen och MTs, eller vid specifika tidpunkter efter blodmjöl eller behandlingsexponering. Till exempel kan SIET användas för att förstå hur absorptiv och sekretoriska processer i myggsöndringssystemet regleras av ^hormoner28 samt olika utfodringsbeteenden och uppfödningsförhållanden25. Tidigare arbete med hjälp av SIET avslöjade platser som är involverade i jontransport längs analpapillen och ändtarmen av larval och vuxna ^myggor24,28. Det nuvarande protokollet, som tidigare beskrivits av Paluzzi och ^kollegor26, mäter Na⁺ fluss över rektal pad epithelia för den vuxna kvinnliga ändtarmen (figur 2).

Det sista segmentet av myggutsöndringssystemet kräver samordnad muskelrörelse för att hjälpa till att blanda mat och utsöndra ^avfall26. Icke-absorberbara produkter av matsmältningen från midgut, tillsammans med primär urin som utsöndras av MTs, passerar genom pylorisk ventil och levereras till ^bakgut2. Spontana hindgut sammandragningar börjar vid pyloric ventilen och förekommer i peristaltiska vågor, som vidarebefordras över ileum genom samordnad sammandragning av cirkulära och längsgående muskler som omger den basala ytan av ^{epitelceller26}. Slutligen hjälper musklerna i ändtarmen till att driva och eliminera avfall genom analkanalen. Även om insekt hindgut motility är myogena, kräver extracellulär ^{Ca2 +} för att producera spontana sammandragningar, kan dessa processer också regleras neuronally26,29,30. Denna exogena reglering av nervsystemet är viktig efter utfodring, eftersom djuret måste utvisa avfall från tarmen och återställa hemolymfbalansen31. Som ett resultat, utföra in vitro bioassays för att identifiera myostimulatory eller myoinhibitory neuropeptides är användbart för att bedöma hur neurokemikalier påverkar hindgut motility. Det nuvarande protokollet, som utförs av Lajevardi och ^Paluzzi28, använder videoinspelningar för att undersöka ileal motilitet som svar på neuropeptider (figur 3). På samma sätt kan en kraftgivare eller impedansomvandlare också användas för att observera spår av sammandragningar genom en programvara för ^{datainsamling32,33}. Men med hjälp av videoteknik kan vi visuellt bedöma organet och ytterligare analysera med hjälp av en delmängd parametrar för att identifiera hormonernas roll på hindgutmotilitet.

Att använda dessa tekniker kan hjälpa till att karakterisera faktorer som reglerar och samordnar vätske- och jontransport längs utsöndringssystemet tillsammans med hindgutmotilitet. Viktigt är att en funktionell koppling mellan det diuretiska svaret från MTs och hindgut motility stöds, eftersom diuretiska hormoner, såsom _DH31 och 5HT, kännetecknas av deras förmåga att stimulera vätskeutsöndring av MTs, har också visat sig uppvisa myotropa åtgärder längs mygga hindgut21,34,35 . Dessa resultat belyser vikten av strikt samordning mellan MTs och hindgut under händelser såsom post-prandial diuresis i insekter som kräver snabb avfall eliminering.

Häri beskrivs det detaljerade tillvägagångssättet bakom Ramsay-analystekniken för att mäta vätskeutsöndringshastigheten i myggan, A. aegypti, och användningen av jonselektiva mikroelektroder för att bestämma Na ⁺ koncentrationer inom den utsöndrade vätskan i MTs, vilket när de kombineras gör det möjligt att fastställa transepithelial jontransporthastigheter. Dessutom beskrivs scanning jonselektiv elektrodteknik och hindgutkontraktionsanalyser för att mäta jonflöde respektive motilitet, vilket hjälper till att klargöra hormonell reglering av bakguten (figur 4).

Protocol

1. Göra silikonfodrade rätter OBS: Detta steg bör göras före experimenten. Dessa rätter kommer att göras för att förbereda analysrätten för dissekeringar och för kontraktionsanalysexperiment. Förbered silikonet med hjälp av ett silikonelastomersats enligt tillverkarens rekommendationer. Blanda de tvådelade flytande komponenterna i ett förhållande av 10 till 1. Blanda försiktigt och noggrant genom att invertera men se till att minimera bubbelbildningen. Hä…

Representative Results

Tillämpning av DH31 mot ostimulerade MTs resulterar i en betydande ökning av vätskesekrendehastigheten, vilket bekräftar dess roll som ett diuretiskt hormon i Aedes myggor (figur 1A). När tubuler behandlas med AedaeCAPA-1 observeras en minskning av utsöndringshastigheten i DH31-stimulerade MTs. Figur 1B visar användningen av jonselektiva elektroder för att mäta Na+ koncentrationer i de utsöndrade dropp…

Discussion

Vid intag av en blodmåltid står hematofaginsekter inför utmaningen med överskott av lösgöring och vatten i deras hemolymf2. För att klara av detta har de ett specialiserat utsöndringssystem, som är tätt kontrollerat av hormonella faktorer, vilket gör det möjligt för insekterna att snabbt initiera post-prandial diuresis. Ramsay-analysen och användningen av jonselektiva mikroelektroder möjliggör mätning av vätskeutsöndringshastigheter tillsammans med jonkoncentrationer och transpo…

Materials

1 mL syringes	Fisher Scientific	14955456
35 mm Petri dishes	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	1B100F-4	used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)	World Precision Instruments	1B200F-4	used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)	World Precision Instruments	TW150-4	used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad	Diamed	GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution	Sigma-Aldrich	41716
Faraday cage	Custom		Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	157740
Forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools	91150-20
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-748A
Hydrated mineral oil	Fisher Scientific	8042-47-5	Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera	Luminera	INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed)	World Precision Instruments	MMJL and MMJR	Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light	Fisher Scientific	0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel)	Fine Science Tools	26002-10
Non-hardening modeling clay	Sargent Art		Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET)	Olympus	customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81395
Scalpel Blade	Fine Science Tools	10050-00
Scalpel Handle	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's Drosophila medium	Sigma-Aldrich	S0146
SIET system	Applicable Electronics	customized system	Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire	World Precision Instruments	AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A	Fluka	99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes	Fisherbrand	FB012921	Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical Company	NC9285739
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
VWR advanced hotplate stirrer – aluminum	VWR	9578	Specific brand is not important