Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Spierstamcellen blijven geassocieerd met hun endogene niche en kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld door siRNA-transfectie. Deze methode maakt het mogelijk om spierstamcellen in cultuur te analyseren in een setting die meer lijkt op de in-vivo situatie dan standaard 2D-kweekmodellen door de niche te behouden. Begin met het snijden van steriele pasteurpipetjes met een diamantpen.

Gebruik voor elke muis een pipet met grote boring met een opening van ongeveer 0,3 centimeter en een lengte van ongeveer 10 tot 12 centimeter en een tweede glazen pipet met een kleine opening van ongeveer 0,1 centimeter en een lengte van ongeveer 22 centimeter. Maak de randen van beide pipetten glad door de pipetpunten vijf tot 10 seconden in de vlam van een Bunsen-brander te houden met zachte beweging. Bestrijk beide pipetten onmiddellijk voor gebruik met steriel paardenserum door de hele pipet gedurende vijf minuten te vullen met 2 milliliter paardenserum, vervolgens het paardenserum te injecteren en de pipetten vijf minuten bij kamertemperatuur te laten drogen.

Spuit alle apparatuur en de achterpoten van de muis met 70% ethanol. Gebruik een geharde fijn gebogen schaar en een fijne tang om de huid te verwijderen en de onderliggende spieren bloot te leggen. Verwijder de omliggende fascia met de fijn gebogen tang zonder de onderliggende spieren te beschadigen.

Om de tibialis anterior of TA te verwijderen, pak je de distale TA-pees met een tang en knip je deze met een fijne schaar. Terwijl u de TA bij de pees houdt, trekt u deze naar de knie en snijdt u de spier dicht bij de knie om de EDL-spier bloot te leggen. Til de distale EDL-pees op met een gebogen tang en knip met een fijne Vannas-veerschaar.

Stel de proximale EDL-pees bloot door de EDL voorzichtig naar de knie te trekken. Knip vervolgens de proximale pees door met een schaar. Incubeer de EDL-spieren in de reactiebuis bij 37 graden Celsius in een circulerend waterbad.

Stop de spijsvertering wanneer spieren loskomen en enkele mijl vezels zichtbaar zijn. Werken onder een steriele binoculaire microscoop uitgerust met een verwarmingsplaat spoelde de spieren met warm isolatiemedium met behulp van de pipet met grote boring. Dissociëer de spieren met de pipet met grote boring totdat het gewenste aantal myofibers vrij in de oplossing zweeft.

Om het vuil te wassen, gebruikt u de kleine glazen pipet om niet-gecontracteerde myofibers over te brengen naar de tweede put gevuld met isolatiemedium. Breng vervolgens 50 tot 100 niet-gecontracteerde myofibers over naar één put van een 24 putplaat gevuld met myofibercultuurmedium. Incubeer de myofiberen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 72 tot 96 uur.

Transfect myofiber geassocieerde spierstamcellen vier uur na myofiber isolatie. Combineer 25 microliter Opti-MEM met het respectievelijke volume siRNA met 25 microliter Opti-MEM met 1,5 microliter transfectiereagens. Incubeer het reactiemengsel gedurende vijf minuten en voeg het toe aan de cellen in de 24 well-plaat.

Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius voor het respecteren van de tijd. Alleen kritische stappen van het immunofluorescente kleuringsprotocol worden hier gedemonstreerd. Gooi voorzichtig het medium myofibercultuur weg terwijl u een oplossing in de put achterlaat.

Voeg 500 microliter 2% paraformaldehyde toe om de myofiberen te fixeren met hun aangrenzende spierstamcellen. Incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig en was de myofibers drie keer met PBS.

Bedek de plaat met tinfoil tijdens incubatiestappen na de incubatie met secundaire antilichamen. Gebruik een hydrofobe pen om een cirkel te tekenen op een microscopische glazen dia. Breng vervolgens de myofibers in het kleinst mogelijke volume over naar de dia en verspreid ze.

Verwijder de resterende vloeistof met de pasteurpipet met kleine boring of een pipet van 200 microliter. Gebruik twee druppels waterig bevestigingsmedium en bedek de myofibers met een afdekslip. Laat de dia’s vervolgens drogen en bewaar ze bij vier graden celsius in het donker, gevolgd door microscopische analyse.

Dit protocol toont afleiding en cultuur van enkele myofiberen uit muriene EDL-spieren. Immunofluorescente kleuring voor Pax7 werd gebruikt om kernen van spierstamcellen te identificeren. Het vergrootte gebied legt de myofiber bloot met zijn aangrenzende spierstamcel en toont het PAX7-immunofluorescentiesignaal in de kern van een spierstamcel.

Spierstamcellen myogene progressie kan worden geanalyseerd door markerexpressie. Aanwezigheid van Pax7 en afwezigheid van MyoD-expressie wordt geassocieerd met rustige spierstamcellen van vers geïsoleerde myofibers. MyoD-expressie kan worden waargenomen in prolifererende spierstamcellen.

Na 72 uur vormen spierstamcellen clusters van nakomelingen met verschillende myogene toestanden, die parallel lopen door expressie van verschillende myogene markers. Pax7 alleen cellen zijn zelfvernieuwende stamcellen. Pax7 en MyoD dubbele positieve cellen prolifereren.

Terwijl myo D alleen cellen differentiërende cellen zijn. De siRNA-transfectie van spierstamcellen toonde accumulatie van cytoplasmatisch siRNA op een granulaire manier, wat wijst op een efficiënte opname. Kwantificering van getransfecteerde Pax7-positieve cellen per myofiber toonde aan dat het aantal getransfecteerde cellen na 30 uur tot 74% toenam zonder nadelig effect op het aantal spierstamcellen.

Bij het proberen van dit protocol is het van het grootste belang om de EDL zorgvuldig te ontleden zonder schade aan te richten. Naast siRNA-transfectie is de analyse van transgene dieren of de incubatie met recombinante eiwitten mogelijk voor verdere functionele analyses van spierstamcellen op hun aangrenzende myofiberen.