Intranasal immunisering och mjölksamling i studier av moderns immunisering i Nya Zeeland Vita Kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Studier av moderns immunisering och antikropp överföring är ovärderliga av många skäl eftersom detta är den första vägen för immunitet överföring och efterföljande skydd mot patogener och sjukdom hos nyfödda och spädbarn. På grund av likheter i placentation och antikroppsöverföring med människor är kaniner en utmärkt modell av moderns immunisering. I denna videoartikel visar vi tekniker som vårt labb har använt i studier av moderns immunisering i Nya Zeeland White Rabbits, inklusive intranasal immunisering och mjölksamling.

Vi kommer först att beskriva ett exempel tidslinje och serie händelser för en mucosal moderns immunisering studie i Nya Zeeland Vita kaniner. Kvinnliga kaniner immuniseras via intranasalvägen, vilket visas i denna video. Beroende på studien kan vaccinet kräva ett uppsving eller behöva ges via en ytterligare väg, såsom intramuskulär immunisering.

Även om det inte avbildas, bör blod samlas in före den första immuniseringen för baslinjemätningar och under resten av studien med jämna mellanrum. Blod erhålls lätt av den centrala öronartären med mild sedering och ett aktuellt smärtstillande medel. Förekomsten av antigenspecifika IgG-nivåer kan mätas i dessa prover.

Kaniner föds sedan upp. Vi föredrar att köpa beprövade uppfödare från leverantörer att använda för att säkerställa en högre graviditetsfrekvens för dessa studier. Beroende på immuniseringstidslinjen kan kaniner få ytterligare immuniseringar under hela graviditeten.

Antigenspecifik IgG överförs transplacentally till satserna. Vid cirka 30 till 32 dagar efter avel kommer gravida att kindle. Vi rekommenderar att du begränsar hanteringen av satserna under de första dagarna för att minimera avstötning från gör.

Blodprover kan samlas in från satserna för att bedöma antigenspecifika IgG-nivåer som överfördes övergående. Blod kan samlas in från ett litet antal satser vid eller nära födelsetiden för att bedöma tidiga antigenspecifika antikroppsnivåer. Förutom ett brett utbud av näringsämnen får kit antigenspecifik IgA från lakterande dos medan du ammar.

Kit avvänjas vanligtvis vid fyra till åtta veckors ålder. Före avtning kan mjölk enkelt samlas in från lakterande gör som visas i denna video. De insamlade mjölkproverna bearbetas sedan för påvisande av antigenspecifik IgA.

Beroende på studien kan vacciner och ett uppsving administreras till satserna och seriella blodprover kan samlas in från satserna i mycket tidig ålder med hjälp av den laterala saphenous venen. Vi kommer nu att demonstrera intranasal immunisering och mjölk insamling i Nya Zeeland White Rabbits.Protocol. Alla procedurer godkändes och utfördes i enlighet med Duke University Institutional Animal Care And Use Committee policyer.

Intranasal immunisering. Material som behövs: Acepromazin, spruta och nål, oftalmiskt smörjmedel, Isofluran, noskon, pipett och pipettspetsar, slemhinnor vaccin. Förbered immuniseringslösningen före djurhantering.

Kaniner sederas med Acepromazine ett milligram per kilo intramuskulärt och bedövas med Isoflurane med en näskon. När helt bedövas som bedöms av ögonlock reflex, tillsätts ett oftalmiskt smörjmedel till varje öga för att förhindra torkning av ögonen och efterföljande hornhinnans ulceration. När labbmedlemmen är redo att administrera vaccinet och kaninen är i ett tillräckligt anestesiplan, stäng av isofluran och syre och ta bort näskonen.

Placera kaninen i dorsal recumbency och prop nacke och huvud i en ungefärlig 45 graders vinkel som möjliggör enkel åtkomst och visualisering av båda alars av labbmedlemmen som administrerar vaccinet. Ladda pipetten med högst 100 mikroliter vaccinlösningen och administrera snabbt lösningen till en näsborre och upprepa proceduren för den andra näsborren. Pipetten ska hållas i ungefär 45 graders vinkel.

Vinkel mot den mediala aspekten av näspassagen. Målet med immunisering är att lösningen ska kontakta nares slemhinnor. Så spetsen bör inte placeras inom narerna eftersom detta kan leda till nötning eller irritation i slemhinnorna och potentiellt påverka immunogeniciteten hos det nasally administrerade vaccinet.

Vaccinet ska administreras snabbt och göras på samma sätt i den andra näsborren. Efter administrering i båda näspassagen hålls kaninen i dorsal recumbency i 30 sekunder för att minimera läckage av vaccinlösningen. Labbet administrerar vanligtvis inte mer än 100 mikroliter per näsborre åt gången.

Om en större volym ska administreras med en maximal total volym på 500 mikroliter kan vaccinet ges i 100 mikroliter alikvoter med en 30 sekunders viloperiod mellan immuniseringarna. Och ytterligare administreringar av vaccin upprepas med 30 sekunders vila mellan varje administrering tills den totala vaccinvolymen levereras. Efter immunisering, placera kaninen på ventrumet för återhämtning och övervaka djuret noggrant tills det kan upprätthålla sternal spermier.

I vissa fall kan vaccinformuleringen inte helt levereras till näshålan och en del av vaccinformuleringen kan finnas kvar på den yttre delen av nares. I det här fallet, eftersom det inte är klart den exakta volymen av vaccinet som levererades korrekt till näshålan, rekommenderar du inte att ytterligare vaccinmaterial återkommer eftersom detta skulle lägga till en odefinierad variabel till experimentet. Det är viktigt att använda en vaccinleveransteknik som ger fullständig och konsekvent leverans av vaccinformuleringen till narerna.

Mjölksamling. Material som behövs: Acepromazin, sprutor och nålar, alkoholpinne, gasväv, oftalmiskt smörjmedel, Isofluran, noskon, oxytocin och en uppsamlingsflaska. Kaniner sederas med Acepromazine ett milligram per kilo intramuskulärt och bedövas med Isoflurane med en näskon.

När helt bedövas som bedöms av ögonlock reflex, en oftalmisk smörjmedel tillämpas på varje öga för att förhindra torkning av ögonen och efterföljande hornhinnans ulceration. Rengör huden över den marginella öron venen med alkoholpinnen. Använd en enmilsspruta och 25 gauge nål, administrera ungefär en till två internationella enheter oxytocin intravenöst av den marginella öronvenen för att inducera mjölk sviken.

På grund av den smidiga muskelavslappningen är det vanligt att kaninen urinerar eller defekerar efter administrering av oxytocin. Efter administrering av oxytocin, tryck på injektionsstället med en gasväv för att ge hemostas. Medan du upprätthåller anestesimasken eller näskonen över kaninens näsa, prop kaninen upp på bakkvartsparterna.

Som en sidoanteckning kan mjölksamling också utföras med djuret i lateral återskum, men labbet finner att insamlingen är lättare när kaninen är uppspänd på rumpan med en assistent som håller kaninen upprätt med anestesimasken. Öppna det sterila röret för att förbereda för mjölkuppsamling och lokalisera bröstvävnaden och tillhörande spenar. Kaniner har vanligtvis fyra till fem par bröstkörtlar.

Spenarna är vanligtvis omgivna av våt päls från ny amning och bröstvävnaden är lätt påtaglig när den är full av mjölk. Greppa vid bröstvävnaden i samband med spenen mellan tummen och pekfingret och applicera ett mjukt masseringstryck på körtelvävnaden i spenens riktning. Placera uppsamlingsröret över spenen för att samla den uttryckta mjölken.

Det kan ibland ta flera minuter för oxytocinet att vara effektivt, och mjölkproduktionen verkar variera mellan bröstkörtlarna. Om mjölkuttrycket inte lyckas, vänta flera minuter eller rotera runt till en extra bröstkörtel. Mjölk från alla spenar kan samlas i samma vidriga.

Vanligtvis kan flera milliliter mjölk lätt samlas in från en lakterande doe. När önskad mjölkvolym har samlats in, stäng av isofluran och syre och ta bort näskonen från kaninen och låt kaninen återhämta sig medan den övervakas noggrant tills djuret kan upprätthålla sternal tillförsel. Representativa resultat.

Bild ett. För moderns studier är det bra att bestämma graviditeten så tidigt som möjligt för att bekräfta att doe inte behöver uppfödas igen. Alternativ för graviditet upptäckt inkluderar palpation, ultraljud, röntgenundersökningar, viktökning, och molekylära tekniker såsom mätningar av insulin tillväxtfaktorer och progesteron.

Adekvata progesteronnivåer är nödvändiga för att upprätthålla graviditeten hos kaniner. Därför har flera studier också bedömt progesteronnivåer hos gravida kaniner och visat förhöjda nivåer i förhållande till icke-gravida kaniner, särskilt under organogenes runt mitten av graviditeten. Som visas i figur ett kan förhöjda progesteronnivåer detekteras hos gravida kaniner jämfört med icke-gravida kaniner även efter parning med en dollar bekräftades för alla gör.

Serum progesteron nivåer mättes med hjälp av en automatiserad chemiluminescent analys. Figur två. Antigenspecifik IgG som överfördes övergående under dräktigheten kan mätas i serumet i satserna av Elisa.

Blod kan samlas in från ett litet antal satser vid eller nära födelsetiden för att bedöma tidiga antigenspecifika antikroppsnivåer. Seriell blodsamling är tekniskt mycket lättare eftersom satserna åldras och ökar i storlek. Som avbildas i figur två kan serumnivåer av antigenspecifik IgG i satserna mätas och jämföras med moderns nivåer.

Maternally överförda IgG nivåer är högre vid födseln och minskar med tiden. Bild tre. Kaninmjölk kan samlas in som visas i denna video och bearbetas för att mäta totala och antigenspecifika antikroppsnivåer av Elisa.

Som framgår av denna siffra utgör IgA en betydande del av de totala antikropparna i bröstmjölken som är tillgängliga för passiv överföring till satserna. Både IgA- och IgG-nivåerna är betydligt högre än IgM.Summary. Denna videoartikel beskriver och visar administrering av intranasala vacciner och insamling av mjölk från lakterande kaniner som ett sätt att bedöma slemhinnor immunitet i en translationellt lämplig modell av moderns immunisering.

Avbildad är en sammanfattande bild för en typisk moderns intranasala immunisering studie design som innehåller immuniseringar, avel, kindling, laktation och antikropp överföring.