Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Screening peptider, der aktiverer MRGPRX2 ved hjælp af manipulerede HEK-celler

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Journal (Immunology and Infection)

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Journal (Immunology and Infection)

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Click here for the English version

Screening peptider, der aktiverer MRGPRX2 ved hjælp af manipulerede HEK-celler

Article DOI: 10.3791/62448-v

November 6th, 2021 •

Shammy Raj¹, Lei Lu², Larry D. Unsworth¹

¹Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, ²School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 6th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Teknikker til generering af et bibliotek af korte peptider, der kan aktivere mastceller via MRGPRX2-receptoren, beskrives. Tilknyttede teknikker er nemme, billige, og kan udvides til andre celle receptorer.

Transcript

I dag vil vi demonstrere en metode til at screene et peptidbibliotek mod en nyligt opdaget masterreceptor, som er Mas-relateret G-proteinreceptor X2, også kendt som MRGPRX2-receptor. Mastceller er en integreret del af immunsystemet og spiller en afgørende rolle i både medfødte og adaptive immunresponser. Mastceller aktiveres enten af den antigenbundne Fc epsilon R1-receptor eller af den nyligt opdagede X2-receptor.

Aktivering af overfladebundet X2-receptor, har været forbundet med flere immunologiske og betændte sygdomme, og derfor er det vigtigt at forstå denne receptors bindende mekanisme til sine ligands. For at gøre dette har vi udviklet et bibliotek af små peptidmolekyler og har screenet dem mod X2-receptorer, der er overekstremerede på hæs. I undersøgelsen, en peptid bibliotek blev bygget ved hjælp af enkle og alsidige teknikker alanin scanning, og aminosyre afkortninger.

Heck293 siger, udtrykker X2 receptorer, når de aktiveres med peptider og bred-type hexis blev brugt som kontrol. I afkortning frigivelse ved aktivering blev overvåget for at studere X2-baserede aktivering. Eksperimentelt er Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye begejstret ved 340 og 380 nanometer, mens emissionen registreres ved 510 nanometer.

Ved calciumbinding øges fluorescensintensiteten ved 340, mens fluorescensintensiteten ved 340 stiger, mens 380 nanometer falder. Farvestoffet deponeres derefter ved forholdet mellem fluorescensintensiteten ved 340, og det, der er af 380 nanometer. De 340 af en 380 ratio, er proportional med den intracellulære calcium, værdien af det, kan beregnes, ved Grynkiewicz ligning.

Tabbing forholdet mellem to fluorescens intensiteter, effekten af eksperimentelle faktorer som fortynding, photobleaching, farvestof lækage, og dufttætheder er opdaget. Så lad os uden yderligere forsinkelse starte eksperimentet. At identificere ligands af mast celle MRGPR X2 receptor, generator N-afkortet, C-afkortet, og N + C-afkortet peptid bibliotek, ved afkortning af N-terminal, C-terminal, og N + C-terminal aminosyrer af pam-12 misproctivity.

Brug solid fase peptid syntese til at syntetisere peptider. Rediger endeterminalen til en indstillet tidevandsgruppe og C-terminal til amide-gruppe. Generer og alaniner kan peptid bibliotek, ved at erstatte de respektive aminosyrer af pam-12 af Alanine, en ad gangen.

Rediger slutterminalen til en setidegruppe og C-terminal til amide-gruppe. Forbered kulturmedium ved at supplere høj glukose DMEM, med 10% fosterkvæg serum, to millimolar L-Glutamin, hundrede enheder pr ml penicillin, og hundrede mikrogram, pr ml af en streptomycin. Ud over cellerne i tee sue kultur traited, 375 kultur kolbe ved 37 grader Celsius, 5% CO2, indtil de er 75 til 80% sammenflyttet.

Når 75% sammenløb, vaske cellerne og tilføje to til tre ml Proof-C, at løsne cellerne. Når cellerne er løsnet, skal du samle cellerne i Proof-C. Tilsæt seks til ni ml frisk medium.

Centrifugere cellerne ved 1620g i tre til fem minutter. Efter centrifugering skal supernatanten kasseres for at opsamle pelleten. Resuspend cellerne i frisk kultur medium.

Fortynd cellerne, som pr den ønskede koncentration. Ved 200 mikroliter af celleopse suspension med koncentrationen af 200.000 celler, hæld ambon i hver brønd for at søge 40.000 celler pr. Brønd. Beskyt cellerne i 24 timer i 37 grader Celsius, 5% CO2 inkubator.

Brug Fura-2 AM farvestof til eksperimentet. Tilsæt 50 mikroliter DMSO i 50 mikrogram Fura-2 AM, for at forberede en millimolar skarp opløsning af Fura-2 AM farvestof. Tilsæt en mikroliter af en millimolar Fura-2 AM farvestof pr ml frisk medium til at forberede fortynding medium af en mikromolar farvestof koncentration.

Fjern 96-brøndspladen fra inkubatoren og kassér mediet. Udskift mediet med frisk fortyndingsmedium. Tilsæt 200 mikroliter fortyndingsmedium i hver brønd.

Inkuber cellerne i 30-40 minutter i 37 grader Celsius, 5% CO2 inkubator. Mens cellerne inkuberes, skal du indstille pladelæseren. Indstil temperaturen til 37 grader Celsius.

Vælg Flex i indstillinger. Indstil læsetilstanden til fluorescens og bundlæsning. I Wavelengths, sæt antallet af bølgelængder til to.

Indstil excitationen til 340 nanometer og 380 nanometer. Indstil emissionen til 510 nanometer. Lad følsomheden være standard.

I Timing skal du indstille intervallet til 3,9 sekunder. Indstil køretid til 94 sekunder for at få 25 antal læser. Vælg derefter typen Assay Plate.

Vælg derefter de brønde, der skal læses. I Compound Transfer, indstille overførsler til en, og indledende volumen til hundrede mikroliter. Indstil PipetteHøjde til hundrede mikroliter, Volumen til 50 mikroliter og Time Point til 36 sekunder for at tilføje forbindelsen og for at passe aflæsningen.

Vælg derefter pladetypen Sammensat kilde. Lad Triturate ikke bruges. Vælg layoutet Tip og PipetteTips.

For sammensatte og spids kolonner, vil forbindelsen blive overført på i kolonne en af de sammensatte plade. Angiv tipkolonnen til én og sammensat kolonne til én. Overlad Autokalibrering til On.Click OK. Efter 40 minutters inkubation fjernes mediet.

Vask cellerne med XDB-bufferen. Tilføj hundrede mikroliter af XDB buffer til fluorescens læsning. Tag pladen til fluorescensaflæsning.

Når pritchett har nået 37 grader Celsius, skal du trykke på læsekammeret, at sætte assay plade i fluorescens pladelæser. Tryk på kilden for at sætte den sammensatte plade. Forbered den sammensatte plade ved at tilføje 200 mikroliter af respekterede peptider ionomysin og EGTA til at vende X løsninger.

Tryk på tip pratt for at sætte tipboksen. Brug sort spids for at undgå spids autofluorescence. Når pladerne er blevet opbevaret, og hvis du bruger indstillingerne for softwaren og tryk på Læs.

Bestem calciumkoncentrationen fra fluorescensforholdet ved Grynkiewicz-ligningen. Vist er fluorescens data pam god peptid. Som det kan ses, efter peptidtilsætning ved 36 sekunder, falder fluorescens ved 340 nanometer, der er luker, med 380 nanometers rekordfald.

Data er repræsenteret som forholdet mellem 340, til forholdet mellem 380 signal. De viser, at signalerne stiger efter peptidtilsætning. Dette tal er de repræsentative data for en aktiverende peptid.

Figur A viser fluorescenssignalerne for et aktiverende peptid. Repræsenterende data svarer til cram12 Peptid blev tilføjet efter at have oprettet en baseline for udbud cykler, som vist ved ado. Figur B viser forholdet mellem fluorescensemission efter excitation ved 340 nanometer og fluorescensemissionen efter excitation ved 380 nanometer.

Dette tal er de repræsentative data for det tomme. Figur A viser fluorescenssignalerne for det tomme. HTB blev tilsat efter fortynding af en baseline for 10 fodringscyklusser som vist af ado.

Figur B viser rationen af fluorescensemission efter excitation ved 340 nanometer til rationen af florescensemission efter excitation ved 380 nanometer. Dette tal er de repræsentative data for standarderne for kalibrering af farvestoffer. Figur A viser, at ionomycin blev tilføjet ved 10. aflæsninger, som det fremgår af ado for at få maksimal fluorescens i cashem-bundet tilstand.

EGPA Triton X hundrede blev tilføjet efter 20 aflæsninger som vist af ado, der får minimum signal. Figur B viser forholdet mellem fluorescensemission efter excitation ved 340 nanometer og fluorescensemissionen efter excitation ved 380 nanometer. Disse værdier er yderligere sat i Grynkiewicz ligning for at få den intracellulære cache af koncentration.

Denne figur viser karakteriseringen af en repræsentativ peptid for at bekræfte sekvensen og renheden. Figur A viser den lodrette masse af den repræsentative peptid sekvens WNK WAL var 857,90 farvestof udtynding. Som er vist ved N over Zed forholdet i Masse Spektroskopi.

Figur B viser en peptid renhed på 99%, som bekræftet af HPLC. Denne peptid tilhører N + C-afkortet peptid bibliotek. Afslutningsvis er den metode, der er beskrevet her, en nem og alsidig, som kan være effektivt og lys til den sidste skala calciumbaseret screening.

Der er dog flere faktorer, der bestemmer kvaliteten af data, og dermed skal makeuppen optimeres til et givet celleinstrumentsystem. Tak.

X

Simple Hit Counter