הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

פרוטוקול זה מתאר רמה תאית מייצבת וחוזרת על הנשימה בהדמיית ויוו של הלבלב עם חלון הדמיה תוך-וינטלית חדשנית בלבלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע הדמיה תלת ממדית ללא תנועה עם רזולוציה עד לרמה התאית במשך שלושה שבועות בלבלב של עכבר חי. התחל על ידי הכנת הפלטפורמה הכירורגית וחיטוי המשטחים עם 70%אתנול.

לאחר נשימה, השתמש בבדיקה רקטלית עם כרית חימום הנשלטת על ידי הומיאותרמיה כדי לפקח על טמפרטורת הגוף. הסר שיער מהאגף השמאלי של העכבר ולהחיל אלכוהול ויוד לחלופין, מסתובב מאתר החתכים אל המשטח החיצוני, לעולם לא חוזר לאתר החתירה, ומסתיים ביוד. לאחר מכן, לעשות 1.5 ס”מ חתכוך על האגף השמאלי של העכבר, לנתח את העור ואת השריר.

השתמש בתבל שחור או ניילון 4-0 כדי לבצע תיל מחרוזת ארנק בשולי החתיכה. משוך את הטחול בזהירות עם מלקחיים טבעת ולזהות את הלבלב. הצבת החלון על אגף העכבר, להעביר את הטחול ואת הלבלב דרך המרחב הפתוח של החלון.

לאחר מכן, הניחו בעדינות את הלבלב על צלחת חלון ההדמיה תוך הנחת הטחול על המרחב הפתוח של החלון. הזריקו פאנק-1 נוקליט אדום ישירות לתוך הלבלב. השתמש מחט קטטר 31-מד כדי להחיל טיפות של דבק ציאנואקרילט n-Butyl לשולי חלון ההדמיה, הבטחת כמות מינימלית של דבק מוחל.

יש למרוח בעדינות זכוכית כיסוי עגולה 12 מ”מ על שולי חלון ההדמיה. לאחר מכן, החזק את לולאת התפר כך שתתאים לחריץ לרוחב של החלון וקשור אותו שלוש פעמים. לבסוף, כדי למנוע את ההפרעה של תפרים הדוקים אלה כאשר העכברים ערים, לחתוך את האתר הפרוקסימלי המרבי של העניבה.

התחל על ידי הפעלת המיקרוסקופ התוך-וינטלי, כולל כוח הלייזר. כדי להכניס קטטר וסקולרי, להפעיל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האינדקס והאצבע השלישית. במידת הצורך לחמם את הזנב עם מנורה.

לחטא את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%, ולאחר מכן להכניס קטטר 30-מד לתוך הווריד זנב לרוחב לדמיין את regurgitation של דם בצינור PE-10. יש למרוח סרט משי על הקטטר כדי לייצב אותו. הזרקת FITC dextran ו- TMR dextran, או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות בהתאם לצורך, על פי השילוב של בדיקות פלואורסצנטיות.

הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית חימום הומיאותרמית. לאחר מכן, הכנס את חלון הדמיית הלבלב שהוכן במהלך ההתקנה של מיקרוסקופיה תוך-וינטלית למחזיק החלון. העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.

כדי לבצע הדמיה תוך-ויאלית, התחל בהדמיית הלבלב בהגדלה נמוכה, כגון ארבע פעמים, כדי לסרוק את כל התצוגה של הלבלב בחלון הדמיית הלבלב. לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשת יעד הגדלה גבוהה יותר, כמו 20 פעמים או 40 פעמים, כדי לבצע הדמיה ברמה התאית ברזולוציה רוחבית וצירית כ-0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטרים בהתאמה. בצע הדמיה של Z-stack או זמן-לשגות כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמה התאית, כגון העברת תאים.

מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספקת יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה למעקב אחר איים בודדים למשך עד שלושה שבועות. החלון מושתל בעכבר C57 שחור 6 N עם נוגדן נגד CD31 מוזרק תוך ורידי, מצומד עם פלואורופור Alexa 647, הקל על הדמיה רחבת היקף והדמיה תלת-ממדית מוגדלת של הלבלב. תאי Acinar זוהו בתמונות הממוצעות של רקמת הלבלב בכלי vasculature הסמוך, הדמו באמצעות autofluorescence ו נוגדן אנטי CD31 בהתאמה.

באמצעות שיטת הדמיית הפסיפס, המשלבת תצוגה רחבת שדה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, כ-40 עד 50 איונים עם כלי ההשמדה הסמוך הוצגו באופן חזותי בעכבר MIP-GFP. מחקר קודם הראה כי איונים ניתן לעקוב עד שלושה שבועות באמצעות שיטת הדמיה יציבה זו. כדי לדמיין תאים סרטניים, תאים אדומים נוקליט PANC-1 הושתלו ישירות לתוך לבלב העכבר במהלך הניתוח וכלי הדם הסמוכים היו מוכתמים עם אנטי CD31 מצומד עם Alexa 647.

באמצעות פרוטוקול זה, נוצרו תמונות רחבות של סרטן הלבלב. זה עזר לשייט את השוליים של הגידול, כמו גם להשיג תמונות 3D ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד. השלב הקריטי ביותר בשיטה זו הוא ההשתלה המיומנת של חלון הדמיית הלבלב בעכבר.

באמצעות שילובים אחרים של תאי עכבר פלואורסצנטיים, ובדיקות נוגדנים, ניתן לזהות אינטראקציה דינמית של תאים סמוכים עם איונים או תאים לבטל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על ידי אלה החוקרים את השינוי של האי בתנאים פתופיזיולוגיים שונים וסביבות מיקרו של סרטן הלבלב במקום.