Medicine
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Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards
Chapters
Summary September 2nd, 2021
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Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen unter Beibehaltung des Perikards und seines Inhalts.
Transcript
Diese Methode wird es uns ermöglichen, die Rolle der Perikardhöhle, die das Herz und seinen Inhalt umgibt, bei der Herzreparatur nach einem Myokardinfarkt zu bewerten. Im Vergleich zu herkömmlichen Koronarligaturmethoden zur Modellierung von Myokardinfarkt erhält unsere Methode eine intakte Perikardhöhle, die die Bestimmung von Inhaltsstoffen ermöglicht und deren Rolle nach einer ischämischen Herzverletzung verfolgt. Das Verständnis des Beitrags der Perikardhöhle und der Reaktion des Herzens auf Verletzungen wird wichtige Einblicke in therapeutische Strategien liefern, die auf das Perikard abzielen, um die Herzheilung zu verbessern.
Um mit der Postanästhesie zu beginnen, halten Sie die Pfoten der Maus zurück und positionieren Sie sie auf dem OP-Tisch. Nachdem Sie die Maus auf die Operation vorbereitet haben, wie im Manuskript beschrieben, belüften Sie die Maus mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff als Trägergas mit einem handelsüblichen Beatmungsgerät. Stellen Sie dann eine Rate von 110 Atemzügen pro Minute, ein Tidalvolumen von 250 Mikrolitern und einen positiven exspiratorischen Enddruck von vier Millimetern Quecksilbersäule ein.
Rollen Sie die Maus um 30% auf der rechten Seite, um die linke Seite des Brustkorbs für die Operation zu positionieren. Dann machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter großen seitlichen Schnitt in die Brusthaut, um die Brustmuskeln auf der linken Seite sichtbar zu machen. Machen Sie einen Schnitt von einem Zentimeter von der Mittellinie nach außen, um den Pectoralis major und minor zu schneiden.
Vermeiden Sie übermäßige Blutungen während der Kauterisation blutender Gefäße. Visualisieren Sie die Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe. Machen Sie einen zwei Zentimeter langen Schnitt in den linken Interkostalmuskel, um Luft in die Brusthöhle einzuführen und das Herz und die Lunge von der Inzision abfallen zu lassen.
Um die Interkostale ohne Blutung zu schneiden, stoppen Sie vorübergehend das Beatmungsgerät und erweitern Sie die Öffnung mit einem Kauterisationsgerät. Ziehen Sie die Rippen mit Retraktoren zurück, um das Herz freizulegen. Beobachten Sie dann den Perikard und das darunter liegende Herz unter einem Stereomikroskop.
Legen Sie die Pinzette vorsichtig auf die Perikardoberfläche, um den Perikard und die darunter liegende Herzbewegung zu reduzieren. Visuelle Markierung der LAD-Koronararterie, indem sie ihre Entstehung unter dem linken Anhängsel verfolgt. Führen Sie mit dem Mikronadeltreiber eine geeignete Naht durch den Perikard unter dem LAD.
Beobachten Sie die Naht, die auf der anderen Seite des LAD und des Perikards entsteht. Um das permanente Ligaturmodell darzustellen, binden Sie die Naht, um den Blutfluss durch die Koronararterie einzuschränken und das Blanchieren des vorderen Teils des linken Ventrikels sichtbar zu machen. Schneiden Sie dann die überschüssige Naht mit Hilfe einer Schere ab.
Erhaltungsinjektionen von Analgetika subkutan alle 12 Stunden für 72 Stunden nach der Operation. Nachdem Sie das Isofluran auf 1% reduziert haben, schalten Sie das Isofluran aus, während die Belüftung mit Sauerstoff aufrechterhalten wird. Sobald das Tier Anzeichen einer Atmung zeigt, entfernen Sie den 23-Gauge-Trachealschlauch aus dem Maul und legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig, um die Wiederaufnahme der Atmung zu überwachen.
Warten Sie, bis sich die Maus im Käfig erholt hat, wobei ein Teil des Käfigs auf ein Wärmekissen gelegt wird, um eine externe Wärmequelle bereitzustellen. Überwachen Sie den Gesundheitszustand der Maus täglich für sieben Tage, indem Sie die Schnitte und das Unbehagen der Tiere auswerten. Falls erforderlich, Verabreichen Sie Antibiotika für eine erfolgreiche Genesung nach der invasiven Operation.
Nachdem Sie die Maus unter Vollnarkose mit Sauerstoff gehalten haben, legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Bühnenplattform und befestigen Sie die Pfoten an den EKG-Elektroden. Dann scheuern Sie die Brust. Erfassen Sie EKG-Bilder mit Schallkopfsonde und Kontaktgel und analysieren Sie sie mit der entsprechenden Software.
Schalten Sie nach der nichtinvasiven EKG-Beurteilung das Isofluran aus und bringen Sie die Maus in den Käfig zurück. Fixieren Sie das Herz in 10% Formalin für mindestens 24 Stunden. Schneiden Sie die Probe mit einer geraden Rasierklinge durch den rechten Ventrikel, das interventrikuläre Septum und den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass der Schnitt durch die Mitte der Infarktzone verläuft.
Und dann bettet Paraffin die Gewebeproben ein. Die geschnittenen Abschnitte werden dann in eine Montagekassette gelegt, um sie weiter in Paraffin einzubetten und anschließend in fünf Mikrometer dicke Abschnitte zu zerlegen. Nach dem Platzieren der Gewebeschnitte auf Objektträgern wird mit Toluol entparaffiniert und Alkohol mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Dann rehydrieren. Als nächstes färben Sie den Abschnitt mit 0,1% Siriusrot in Pikrinsäure für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Abschnitt drei Minuten lang mit 0,5% Essigsäure, gefolgt von einer Minute lang mit 70% Ethanol.
Entwässern Sie den Abschnitt in umgekehrter Reihenfolge der Wäschen mit steigenden und abgestuften Ethanolkonzentrationen vor der Montage für die mikroskopische Auswertung. Die erfolgreiche Myokardinfarktinduktion mit der modifizierten Koronarligatur wurde durch die Untersuchung der funktionellen Parameter und strukturellen Merkmale des Herzens beurteilt. In Bezug auf die Funktion wurde die verminderte Ejektionsfraktion des linken Ventrikels innerhalb von drei bis vier Wochen nach dem Myokardinfarkt durch Echokardiographie beurteilt.
Die histologische Färbung zeigte, dass die funktionellen Veränderungen mit einer signifikanten Fibrose der linken Ventrikelwand einhergingen, die durch die Quantifizierung der picrosiriusrot gefärbten Fibrose in den Querschnitten des Herzens vier Wochen nach dem Infarkt mit den gestörten oder intakten perikardialen Koronarligaturmodellen bestätigt wurden. Die Kombination der Fluoreszenzperlenmarkierungsmethode mit der Durchflusszytometrie lieferte einen Ansatz, um die residenten Gata6-positiven Perikardmakrophagen zu verfolgen. Wichtig ist, dass wenig bis gar keine Markierung im Herzen oder Blut nachgewiesen wurde.
Nach einem Myokardinfarkt kann die Verlagerung der Zellen durch Durchflusszytometrie und Bildgebung verfolgt werden. Die Quantifizierung der fluoreszierenden perlenmarkierten perikardialen myeloischen Zellen mit oder ohne Myokardinfarkt wird gezeigt. Es ist darauf zu achten, dass das dünne Perikard während des Eingriffs nicht versehentlich gestört oder gerissen wird.
Diese Methode kann mit einer Zell- oder Effektorblockade kombiniert werden, die es ermöglicht, den Einfluss der Perikardkomponente auf die Heilungsreaktion im infarktierten Herzen zu verfolgen und zu bestimmen. Wir haben festgestellt, dass die Perikardhöhle das Herz nach einer Verletzung schützt, die teilweise durch residente Perikardmakrophagen vermittelt wird. Dieser Ansatz eröffnet ein neues Forschungsgebiet für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
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