Neuroscience
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माउस दिमाग के मुक्त फ्लोटिंग Immunostaining
Chapters
Summary October 7th, 2021
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यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक कुशल और पुनरुत्पादक दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जिसमें परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग, ऊतक बढ़ते और इमेजिंग शामिल हैं।
Transcript
माउस के दिमाग के इम्यूनो-हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक है। हालांकि, मस्तिष्क हिस्टोलॉजी परिणामों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन विभिन्न शोधकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकता है। हम माउस दिमाग के हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक स्थापित पद्धति प्रस्तुत करते हैं जो पुनरुत्पादक, विश्वसनीय और कुशल साबित हुई है।
प्रक्रिया को प्रदर्शित करने में मदद करने के लिए डॉ Chunmei वांग, मेरी प्रयोगशाला से एक सहायक प्रोफेसर एक आठ से 16 सप्ताह पुराने C57 काले / 6 जे माउस में सफल anesthetization की पुष्टि करने के बाद, एक फोम बोर्ड पर माउस को ठीक करें और छाती और पेट पर मध्य रेखा के साथ एक अनुदैर्ध्य सतही चीरा बनाने के लिए, फिर छाती और पेट की मांसपेशियों की दीवार को उजागर करने के लिए त्वचा को एक तरफ ले जाएं। अगला, जिगर और आंत को उजागर करने के लिए मांसपेशियों की परत में एक चीरा बनाएं। फिर, कैंची का उपयोग करके, वक्ष को खोलने और दिल और फेफड़ों को उजागर करने के लिए रिबकेज को काट दें।
हेमोस्टेटिक संदंश का उपयोग करते हुए, कार्य क्षेत्र को चौड़ा करने के लिए रिबकेज को एक तरफ खींचें। अगला। एक परफ्यूजन कैनुला रखने के लिए, सीधे एक कुंद प्रवेशनी के साथ बाएं दिल वेंट्रिकल में प्रवेश करें और इसे आरोही महाधमनी में सावधानीपूर्वक डालें। परफ्यूजन के दौरान जगह में कैनुला को ठीक करने के लिए फोम बोर्ड पर कैनुला और युग्मित टयूबिंग के संयोजन के आसपास पिन रखें, और परिसंचरण से रक्त के बहिर्वाह की अनुमति देने के लिए सही आलिंद को काटने के लिए आगे बढ़ें।
खारा के साथ छिड़काव के लिए, खारा दबाव स्विच को चालू करें और 40 से 60 मिलीलीटर खारा के साथ माउस को ट्रांसकार्डियल रूप से पारफ्यूज करें। दाहिने आलिंद से बहिर्वाह और जिगर के रंग को बारीकी से देखें। इसके बाद, फॉर्मेलिन के साथ perfuse करने के लिए, खारा दबाव स्विच को बंद कर दें और माउस को 10% तटस्थ-बफ़र्ड फॉर्मेलिन के 40 मिलीलीटर के साथ परफ्यूज करने के लिए फॉर्मेलिन दबाव स्विच को चालू करें।
कंपन के सबूत के लिए जानवर के अंगों का निरीक्षण करें। मस्तिष्क अलगाव के लिए, सिर को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें और खोपड़ी को उजागर करने के लिए इंटेग्यूमेंट के साथ एक मध्य रेखा चीरा बनाएं, फिर त्वचा और मांसपेशियों के लगाव को ट्रिम करें। इसके बाद, कक्षीय रिज पर एक कटौती करें और आईरिस कैंची के तेज छोर को फोरमेन मैग्नम में रखें।
खोपड़ी की आंतरिक सतह के साथ कैंची को आगे बढ़ाएं, मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए ऊपर की ओर दबाव बनाए रखें। फिर, खुली खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने से पहले पार्श्विका और ललाट हड्डियों और मेनिंग्स को सावधानीपूर्वक हटा दें। एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम की ऊंचाई समायोजन प्लेट के शीर्ष पर सूखी बर्फ रखें और सफेद ठंढ दिखाई देने तक प्रतीक्षा करें, फिर सुक्रोज के जमने के बाद एक ठोस आधार परत बनाने के लिए प्लेट के शीर्ष पर 30% सुक्रोज के पांच मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक फैलाएं।
इसके बाद, सभी मस्तिष्क के नमूनों को 30% सुक्रोज के 500 माइक्रोलीटर के साथ सुक्रोज बेस के शीर्ष पर एक पंक्ति में क्षैतिज रूप से रखें। ठंड के पांच से 10 मिनट के बाद, जब मस्तिष्क कठोर और सफेद हो जाता है, तो वांछित परत या क्षेत्र तक पहुंचने तक मस्तिष्क को ट्रिम करें, फिर, 25-माइक्रोमीटर-मोटी वर्गों को उत्पन्न करने के लिए ट्रिम मोड से फ़ीड मोड और सेक्शन ब्रेन ऊतक पर स्विच करें। इसके बाद, पीबीएस से भरी एक 48-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें और एक माउस मस्तिष्क के लिए पांच कुओं को चिह्नित करें।
पेंटब्रश का उपयोग करके, एक अनुभाग एकत्र करें और इसे एक अच्छी तरह से रखें, फिर उसी माउस के बाद के अनुभाग को इकट्ठा करें और इसे दूसरे कुएं में रखें। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि पांचवें कुएं तक पहुंच न जाए, तब तक पहले से पांचवें कुएं में छह से 10 तक वर्गों को अच्छी तरह से रखा जाता है, और इसी तरह। पीबीएस से भरे छह-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में एक सेल छलनी रखें और, एक पेंटब्रश का उपयोग करके, सेल छलनी में मस्तिष्क वर्गों की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करें।
सेल छलनी को शेकर पर पीबीएस से भरे एक और अच्छी तरह से स्थानांतरित करके पीबीएस में इन वर्गों को कुल्ला करें। फिर, सेल छलनी से मस्तिष्क वर्गों को 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बायोटिन-लेबल वाले डब्ल्यूएफए के एक मिलीलीटर होते हैं और रात भर में 50 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर इनक्यूबेट करते हैं। अगले दिन, पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों को कुल्ला करें जैसा कि पहले दिखाया गया था, फिर वर्गों को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें स्ट्रेप्टाविडिन-डेलाइट 488 समाधान का एक मिलीलीटर होता है और एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट होता है।
पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों को फिर से धोने के बाद, उन्हें दो घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट करें, इसके बाद एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेशन। अगले दिन, पीबीएस कुल्ला के बाद, दो घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में वर्गों को इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 100 मिलीलीटर के साथ दो पेट्री व्यंजनों को भरें और एक छलनी से सभी मस्तिष्क वर्गों को पहले पकवान में स्थानांतरित करें।
मस्तिष्क वर्गों को कुडल से रोस्ट्रल तक न्यूरोएनाटॉमिकल क्रम में संरेखित करें। फिर, एक स्लाइड को दूसरे डिश में डुबोएं, जिसमें एक छोर थोड़ा सा एक स्टैंड के साथ झुका हुआ है, और एक ठीक पेंटब्रश का उपयोग करके, धीरे से झुकी हुई स्लाइड पर एयर बफर इंटरफ़ेस के ठीक नीचे एक मस्तिष्क अनुभाग रखें। अगला, एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे और धीरे-धीरे बफर को अपने स्तर को कम करने के लिए बफर को हटा दें जब तक कि मस्तिष्क अनुभाग पूरी तरह से हवा बफर इंटरफ़ेस से ऊपर न हो।
इस प्रक्रिया को तब तक दोहराना जारी रखें जब तक कि स्लाइड के निचले भाग तक नहीं पहुंच जाता है और सभी अनुभाग स्लाइड पर माउंट नहीं हो जाते हैं। इमेजिंग के लिए, स्कैनर और कंप्यूटर को चालू करें, फिर स्लाइड्स को लोडिंग डिवाइस के साथ स्लाइड होल्डर में रखें, और होल्डर को स्कैनर में डालें। स्कैनर के लिए सॉफ़्टवेयर खोलें, और उपयुक्त संग्रहण स्थान और स्कैनिंग प्रोफ़ाइल चुनें.
पूर्वावलोकन स्कैन प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करके पूर्वावलोकन स्कैन प्रारंभ करें. स्कैन के बाद, ऊतक का पता लगाने विज़ार्ड खोलें, और इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्रों को सर्कल करें। इमेजिंग के लिए क्षेत्रों को चुनने के बाद, स्टार्ट स्कैन बटन पर क्लिक करें और मशीन को स्कैनिंग समाप्त करने की प्रतीक्षा करें।
परिणाम फ़ाइल की जाँच करें और छवियों को निर्यात करें। यहां दिखाया गया है कि ब्रेग्मा-नकारात्मक 0.82 मिलीमीटर पर कोरोनल माउस मस्तिष्क वर्गों की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति इम्यूनो-हिस्टोकेमिस्ट्री छवियां हैं, जो विस्टेरिया फ्लोरिबुंडा एग्लूटीनिन, आर्जिनिन वैसोप्रेसिन और डीएपीआई के वितरण को प्रदर्शित करती हैं। Wisteria floribunda agglutinin संकेत पूर्वकाल हाइपोथैलेमस और रेटिकुलर नाभिक के पेरिफोर्निकल क्षेत्र में देखे जाते हैं, जबकि आर्जिनिन वैसोप्रेसिन सिग्नल पैरावेंट्रिकुलर नाभिक में देखे जाते हैं।
पहली बार इस प्रोटोकॉल की कोशिश करते समय, हम इसे एक अनुभवी शोधकर्ता की देखरेख में करने का सुझाव देते हैं। प्रोटोकॉल विभिन्न शोधकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच इष्टतम और सुसंगत हिस्टोलॉजिकल परिणाम उत्पन्न करने में मदद करेगा, और इस तकनीक को सीखने वाले शुरुआती लोगों के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगा।
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