माउस दिमाग के मुक्त फ्लोटिंग Immunostaining
Summary
यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक कुशल और पुनरुत्पादक दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जिसमें परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग, ऊतक बढ़ते और इमेजिंग शामिल हैं।
Abstract
माउस दिमाग का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग एक नियमित तकनीक है जिसका उपयोग आमतौर पर तंत्रिका विज्ञान में ऊर्जा चयापचय और अन्य न्यूरोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं के विनियमन के अंतर्निहित केंद्रीय तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, मस्तिष्क हिस्टोलॉजी परिणामों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकता है। प्रत्येक धुंधला प्रयोग के लिए, प्रजातियों, ऊतकों, लक्षित प्रोटीन, और अभिकर्मकों की काम करने की स्थिति में अंतर के आधार पर प्रमुख प्रक्रियाओं को अनुकूलित करना आवश्यक है। यह पेपर विस्तार से एक विश्वसनीय वर्कफ़्लो प्रदर्शित करता है, जिसमें इंट्रा-महाधमनी परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग, ऊतक बढ़ते और इमेजिंग शामिल हैं, जिसका इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा आसानी से पालन किया जा सकता है।
यह भी चर्चा की गई है कि शोधकर्ताओं की व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए इन प्रक्रियाओं को कैसे संशोधित किया जाए। इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता और दक्षता को स्पष्ट करने के लिए, पेरिन्यूरोनल नेट को माउस मस्तिष्क में एंटी-एवीपी एंटीबॉडी के साथ बायोटिन-लेबल वाले विस्टेरिया फ्लोरबुंडा एग्लूटिनिन (डब्ल्यूएफए) और आर्जिनिन वैसोप्रेसिन (एवीपी) के साथ दाग दिया गया था। अंत में, पूरी प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण विवरण ों को संबोधित किया गया है, और अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में इस प्रोटोकॉल के फायदे। एक साथ लिया गया, यह पेपर माउस मस्तिष्क के ऊतकों के मुक्त-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल का पालन करने से इस प्रक्रिया को जूनियर और वरिष्ठ वैज्ञानिकों दोनों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग अध्ययनों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए आसान बनाता है।
Introduction
मोटापे और संबंधित कोमोर्बिडिटीज़ का प्रसार महामारी के स्तर तक पहुंच गया है, जिससे एक जबरदस्त सामाजिक आर्थिक बोझ 1,2 हो गया है। मोटापे के लिए जिम्मेदार जैविक प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए विभिन्न माउस मॉडल विकसित किए गए हैं3,4। क्योंकि केंद्रीय तंत्र इन पशु मॉडलों में ऊर्जा होमोस्टैसिस के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं, माउस दिमाग के न्यूरोएनाटॉमिकल अध्ययन इस क्षेत्र में एक आवश्यक तकनीक बन गए हैं। हालांकि, मस्तिष्क हिस्टोलॉजी तकनीकों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन विभिन्न कारणों से एक ही प्रयोगशाला के भीतर प्रयोगशालाओं और यहां तक कि शोधकर्ताओं के बीच काफी भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी, ऊतक, उपचार, प्रजातियां, अनुसंधान उद्देश्य)। इसलिए, माउस मस्तिष्क के हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है, जिसमें परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग, ऊतक माउंटिंग और इमेजिंग शामिल हैं। इस बीच, शुरुआती लोग अपनी व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल को जल्दी से सीख सकते हैं, मास्टर कर सकते हैं और समायोजित कर सकते हैं।
इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग एक स्थापित विधि है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों (जैसे, मस्तिष्क और परिधीय ऊतकों) में विशिष्ट सेल प्रकारों, एमआरएनए और प्रोटीन की कल्पना करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है 5,6। अधिक विशेष रूप से, ब्याज के एक एंटीजन को एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और एक एंजाइम (जैसे, क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) या एक फ्लोरोसेंट डाई (फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट) से जुड़े एक संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया जा सकता है। इन तकनीकों की उपयोगिता के एक उदाहरण के रूप में, β-एंडोर्फिन [प्रो-ओपिओमेलानोकोर्टिन (पीओएमसी) द्वारा एन्कोडेड एक पेप्टाइड] और सी-फॉस (न्यूरोनल गतिविधि का एक मार्कर) आर्कुएट नाभिक में दाग दिए गए थे। पृष्ठीय raphe नाभिक में tryptophan hydroxylase 2 (सेरोटोनिन संश्लेषण के लिए एक एंजाइम अभिन्न) के विलोपन को arcuate नाभिक 7 में POMC न्यूरॉन्स में सी-फॉस अभिव्यक्ति को कम करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, विटामिन डी रिसेप्टर एमआरएनए के वितरण को माउस मस्तिष्क में सीटू संकरण (आरएनएस्कोप) 8 के माध्यम से मैप किया गया था। यह पेपर फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो के साथ एक विश्वसनीय और कुशल विधि प्रस्तुत करता है, जिसका उद्देश्य माउस मस्तिष्क के हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों की गुणवत्ता और पुनरुत्पादन में सुधार करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के न्यूरोएनाटॉमिकल अध्ययन के लिए एक स्थापित विधि प्रदान करता है, जिसमें परफ्यूजन, ऊतक सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग, ऊतक माउंटिंग और इमेजिंग शामिल हैं। हालांक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जांचकर्ताओं को एनआईएच (K01DK119471 से CW को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, और R01DK120858 YX के लिए), USDA / CRIS (YX के लिए 51000-064-01S), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (# 829565) LT करने के लिए।
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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