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Neuroscience

माउस दिमाग के मुक्त फ्लोटिंग Immunostaining

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62876
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1,4
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक कुशल और पुनरुत्पादक दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जिसमें परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग, ऊतक बढ़ते और इमेजिंग शामिल हैं।

Abstract

माउस दिमाग का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग एक नियमित तकनीक है जिसका उपयोग आमतौर पर तंत्रिका विज्ञान में ऊर्जा चयापचय और अन्य न्यूरोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं के विनियमन के अंतर्निहित केंद्रीय तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, मस्तिष्क हिस्टोलॉजी परिणामों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकता है। प्रत्येक धुंधला प्रयोग के लिए, प्रजातियों, ऊतकों, लक्षित प्रोटीन, और अभिकर्मकों की काम करने की स्थिति में अंतर के आधार पर प्रमुख प्रक्रियाओं को अनुकूलित करना आवश्यक है। यह पेपर विस्तार से एक विश्वसनीय वर्कफ़्लो प्रदर्शित करता है, जिसमें इंट्रा-महाधमनी परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग, ऊतक बढ़ते और इमेजिंग शामिल हैं, जिसका इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा आसानी से पालन किया जा सकता है।

यह भी चर्चा की गई है कि शोधकर्ताओं की व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए इन प्रक्रियाओं को कैसे संशोधित किया जाए। इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता और दक्षता को स्पष्ट करने के लिए, पेरिन्यूरोनल नेट को माउस मस्तिष्क में एंटी-एवीपी एंटीबॉडी के साथ बायोटिन-लेबल वाले विस्टेरिया फ्लोरबुंडा एग्लूटिनिन (डब्ल्यूएफए) और आर्जिनिन वैसोप्रेसिन (एवीपी) के साथ दाग दिया गया था। अंत में, पूरी प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण विवरण ों को संबोधित किया गया है, और अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में इस प्रोटोकॉल के फायदे। एक साथ लिया गया, यह पेपर माउस मस्तिष्क के ऊतकों के मुक्त-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल का पालन करने से इस प्रक्रिया को जूनियर और वरिष्ठ वैज्ञानिकों दोनों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग अध्ययनों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए आसान बनाता है।

Introduction

मोटापे और संबंधित कोमोर्बिडिटीज़ का प्रसार महामारी के स्तर तक पहुंच गया है, जिससे एक जबरदस्त सामाजिक आर्थिक बोझ 1,2 हो गया है। मोटापे के लिए जिम्मेदार जैविक प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए विभिन्न माउस मॉडल विकसित किए गए हैं3,4। क्योंकि केंद्रीय तंत्र इन पशु मॉडलों में ऊर्जा होमोस्टैसिस के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं, माउस दिमाग के न्यूरोएनाटॉमिकल अध्ययन इस क्षेत्र में एक आवश्यक तकनीक बन गए हैं। हालांकि, मस्तिष्क हिस्टोलॉजी तकनीकों की गुणवत्ता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन विभिन्न कारणों से एक ही प्रयोगशाला के भीतर प्रयोगशालाओं और यहां तक कि शोधकर्ताओं के बीच काफी भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी, ऊतक, उपचार, प्रजातियां, अनुसंधान उद्देश्य)। इसलिए, माउस मस्तिष्क के हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है, जिसमें परफ्यूजन, मस्तिष्क सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोस्टेनिंग, ऊतक माउंटिंग और इमेजिंग शामिल हैं। इस बीच, शुरुआती लोग अपनी व्यक्तिगत जरूरतों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल को जल्दी से सीख सकते हैं, मास्टर कर सकते हैं और समायोजित कर सकते हैं।

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग एक स्थापित विधि है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों (जैसे, मस्तिष्क और परिधीय ऊतकों) में विशिष्ट सेल प्रकारों, एमआरएनए और प्रोटीन की कल्पना करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है 5,6। अधिक विशेष रूप से, ब्याज के एक एंटीजन को एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और एक एंजाइम (जैसे, क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) या एक फ्लोरोसेंट डाई (फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट) से जुड़े एक संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया जा सकता है। इन तकनीकों की उपयोगिता के एक उदाहरण के रूप में, β-एंडोर्फिन [प्रो-ओपिओमेलानोकोर्टिन (पीओएमसी) द्वारा एन्कोडेड एक पेप्टाइड] और सी-फॉस (न्यूरोनल गतिविधि का एक मार्कर) आर्कुएट नाभिक में दाग दिए गए थे। पृष्ठीय raphe नाभिक में tryptophan hydroxylase 2 (सेरोटोनिन संश्लेषण के लिए एक एंजाइम अभिन्न) के विलोपन को arcuate नाभिक 7 में POMC न्यूरॉन्स में सी-फॉस अभिव्यक्ति को कम करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, विटामिन डी रिसेप्टर एमआरएनए के वितरण को माउस मस्तिष्क में सीटू संकरण (आरएनएस्कोप) 8 के माध्यम से मैप किया गया था। यह पेपर फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो के साथ एक विश्वसनीय और कुशल विधि प्रस्तुत करता है, जिसका उद्देश्य माउस मस्तिष्क के हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों की गुणवत्ता और पुनरुत्पादन में सुधार करना है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में दोनों लिंगों (8-16 सप्ताह की उम्र) के C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। सभी जानवरों की देखभाल और सभी प्रक्रियाओं को Baylor College of Medicine की Institutional Animal Care and Use Committees द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. परफ्यूजन

नोट: चरण 1.1 - 1.6 एक धुएं हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. संज्ञाहरण
    1. एक desiccator के तल पर रखा एक कागज तौलिया पर isoflurane के 5 मिलीलीटर डालो ( सामग्री की तालिका देखें). माउस को desiccator के अंदर छेद बाधा पर पेश करें और श्वसन के संकेत गायब होने तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: श्वसन के बिना, माउस में अभी भी थोड़े समय के लिए दिल की धड़कन होती है, और यह दिल की धड़कन के गायब होने से पहले फैल जाएगा।
    2. आगे बढ़ने से पहले, पुष्टि करें कि पैर की अंगुली-चुटकी के लिए कोई पलटा नहीं है।
    3. प्रत्येक पैर के माध्यम से एक पिन ड्राइविंग द्वारा एक फोम बोर्ड के लिए माउस को ठीक करें। सुनिश्चित करें कि फोम बोर्ड को तरल स्पिलओवर एकत्र करने के लिए एक ट्रे में रखा गया है।
  2. दिल को उजागर करना
    1. वक्ष और पेट के ऊपर मिडलाइन के साथ एक अनुदैर्ध्य सतही चीरा बनाएं, फिर वक्ष और पेट की मांसपेशियों की दीवार को उजागर करने के लिए त्वचा को एक तरफ ले जाएं। अगला, जिगर और आंत को उजागर करने के लिए मांसपेशियों की परत में एक चीरा बनाएं। अंत में, छाती को खोलने और दिल और फेफड़ों को उजागर करने के लिए कैंची के साथ रिब पिंजरे को काटें। कार्य क्षेत्र को चौड़ा करने के लिए रिबकेज को एक तरफ खींचने के लिए हेमोस्टेटिक संदंश का उपयोग करें।
  3. टर्मिनल रक्त का संग्रह (वैकल्पिक)
    1. एक 1 एमएल सिरिंज डालें ( सामग्री की तालिका देखें) ध्यान से दिल के दाहिने आलिंद में जब तक टिप पूरी तरह से एम्बेडेड न हो जाए। सिरिंज को स्थिर रखें और वांछित मात्रा तक पहुंचने तक धीरे-धीरे रक्त खींचें।
      नोट: ध्यान रखें कि पिछले सही आलिंद में प्रवेश न करें; रक्त के 300-400 μL का संग्रह प्रति वयस्क माउस प्राप्त करने योग्य है। रक्त संग्रह के उद्देश्य के आधार पर थक्का त्वरक या थक्कारोधी जैसे एडिटिव्स का उपयोग किया जा सकता है।
  4. परफ्यूजन कैनुला का प्लेसमेंट
    1. शुरुआती लोगों के लिए, कैंची के साथ दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक छोटा छेद (<1 मिमी) काटें और आरोही महाधमनी में बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से एक कुंद कैनुला (युवा चूहों के लिए 18 जी सुई और वृद्ध चूहों के लिए 21 जी सुई) डालें। वैकल्पिक रूप से, अनुभवी प्रयोगकर्ताओं के लिए, सीधे एक कुंद कैनुला के साथ बाएं दिल के वेंट्रिकल में प्रवेश करें और इसे आरोही महाधमनी में सावधानीपूर्वक डालें।
    2. परफ्यूजन के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए फोम बोर्ड पर कैनुला और युग्मित टयूबिंग के संयोजन के आसपास पिन रखें। वैकल्पिक रूप से, जगह में प्रवेशनी को ठीक करने के लिए हेमोस्टेटिक संदंश का उपयोग करें। परिसंचरण से रक्त के बहिर्वाह की अनुमति देने के लिए सही आलिंद को काटने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: परफ्यूजन कैनुला और युग्मित टयूबिंग परफ्यूजन पंप से जुड़े हुए हैं।
  5. लवणीय के साथ परफ्यूजन
    1. खारा दबाव स्विच चालू करें, और 40-60 मिलीलीटर खारा (0.9% NaCl: 25 °C, pH 7.4) के साथ माउस को ट्रांसकार्डियल रूप से पारफ्यूज करें। दाहिने आलिंद से बहिर्वाह और जिगर के रंग को बारीकी से देखें।
      नोट: एक स्वचालित परफ्यूजन पंप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग 1-2 मिनट के भीतर रक्त को फ्लश करने के लिए किया जाता है। चूंकि पंप की दबाव सीमा 1-300 mmHg है, इसलिए गति को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है। यदि नाक से खारा लीक हो रहा है और / या फेफड़े को फुलाया जाता है, तो दबाव को कम करें और कैनुला को समायोजित करें। एक बार बहिर्वाह में अब रक्त नहीं होता है, तो मस्तिष्क पर्याप्त रूप से खारा के साथ फ्लश हो जाता है। इस बीच, जिगर रक्त से रहित है और भूरे-भूरे रंग का हो जाता है।
  6. फॉर्मेलिन के साथ परफ्यूजन
    1. खारा दबाव स्विच बंद करें और 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन (10% NBF: 25 °C, pH 6.8-7.2, सामग्री की तालिका देखें) के 40 mL के साथ माउस perfuse करने के लिए फॉर्मेलिन दबाव स्विच को चालू करें। कंपन के सबूत के लिए जानवर के अंगों का निरीक्षण करें।
      नोट: पूंछ आंदोलन भी 10% NBF के जलसेक के बाद मनाया जा सकता है. सावधानी: जैसा कि एनबीएफ खतरनाक है, यह सुझाव दिया जाता है कि शोधकर्ता पूरी प्रक्रिया में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे, उपयुक्त श्वसन यंत्र, फेस शील्ड) पहनते हैं।
  7. मस्तिष्क अलगाव9
    1. सिर को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें। खोपड़ी को उजागर करने के लिए इंटेग्यूमेंट के साथ एक मध्य रेखा चीरा बनाएं। कैंची के साथ त्वचा और मांसपेशियों के लगाव को ट्रिम करें।
    2. कक्षीय रिज पर एक कटौती करें, और फिर आईरिस कैंची के तेज छोर को फोरमेन मैग्नम में रखें। खोपड़ी की आंतरिक सतह के साथ कैंची को आगे बढ़ाएं, मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए ऊपर की ओर दबाव बनाए रखें। पार्श्विका / ललाट हड्डियों और meninges को ध्यान से हटा दें। अंत में, मस्तिष्क को धीरे से खुली खोपड़ी से हटा दें।
  8. पोस्ट-फिक्सेशन
    1. मस्तिष्क को 5% NBF के 10 mL और 4 °C पर रात भर के निर्धारण के लिए 15% सुक्रोज से भरे 15 mL ट्यूब में रखें।
      नोट: 5% NBF और 15% सुक्रोज के 10 mL तैयार करने के लिए, 10% NBF के 5 mL और 30% सुक्रोज के 5 mL को संयोजित करें (w / v, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) में भंग हो गया, सामग्री की तालिका देखें। सुनिश्चित करें कि fixative बफ़र की मात्रा कम से कम 10x नमूना से ही बड़ा है। प्रारंभ में, मस्तिष्क बफर में तैरेगा और रात भर के निर्धारण के बाद नीचे डूब जाएगा।
  9. निर्जलीकरण
    1. मस्तिष्क के नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्जलीकरण के लिए 30% सुक्रोज के 10 मिलीलीटर से भरे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जब तक कि यह डूब न जाए।

2. क्रायोसेक्शनिंग (कोरोनल वर्गों)

  1. तैयारी
    1. एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम की ऊंचाई समायोजन प्लेट के शीर्ष पर सूखी बर्फ रखें, और सफेद ठंढ दिखाई देने तक प्रतीक्षा करें। सुक्रोज समाधान पूरी तरह से जमे हुए होने के बाद एक ठोस आधार की एक परत बनाने के लिए प्लेट के शीर्ष पर 30% सुक्रोज के 5 मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक फैलाएं। सभी मस्तिष्क के नमूनों (एक बैच में 5 मस्तिष्क के नमूनों तक) को क्षैतिज रूप से सुक्रोज के शीर्ष पर एक पंक्ति में रखें, और फिर प्रत्येक मस्तिष्क के तल पर 30% सुक्रोज के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: मस्तिष्क तुरंत जमे हुए सुक्रोज बेस से चिपक जाएगा और धीरे-धीरे नीचे से ऊपर तक फ्रीज हो जाएगा। काटने के लिए एक मजबूत आधार बनाने के लिए मस्तिष्क के घुड़सवार हिस्से के चारों ओर अतिरिक्त सुक्रोज रखें।
  2. अनुभागन
    1. ठंड के 5-10 मिनट के बाद, जब मस्तिष्क कठोर और सफेद हो जाता है, तो वांछित परत / क्षेत्र तक पहुंचने तक मस्तिष्क को ट्रिम करें।
      नोट: तापमान को नियंत्रित करने के लिए प्लेट पर सूखी बर्फ की मात्रा को समायोजित करें। तापमान बहुत कम होता है जब बर्फ के क्रिस्टल मस्तिष्क की सतह पर दिखाई देते हैं। तापमान बहुत अधिक होता है जब मस्तिष्क नरम हो जाता है और अब सफेद नहीं होता है।
    2. ट्रिम मोड से फ़ीड मोड और अनुभाग मस्तिष्क ऊतक को 25 μm मोटाई पर स्विच करें। 1x PBS से भरी एक 48-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें, और एक माउस मस्तिष्क के लिए पांच कुओं को चिह्नित करें। एक माउस से प्रत्येक अनुभाग को इकट्ठा करने और इसे एक अच्छी तरह से रखने के लिए पेंटब्रश का उपयोग करें। एक ही माउस के बाद के अनुभाग को इकट्ठा करें और इसे दूसरी अच्छी तरह से रखें।
    3. 2.2.2 को दोहराएं जब तक कि 5 वीं अच्छी तरह से नहीं पहुंच जाता है, तब तक 1-5 वें में अनुभागों को 6-10 अच्छी तरह से रखता है और इसी तरह। एक साथ बाकी दिमाग के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएं। तब तक दोहराएं जब तक कि एक माउस से सभी वर्गों को शारीरिक क्रम में 5 कुओं में एकत्र नहीं किया जाता है।
      नोट: इस प्रक्रिया के बाद, प्रत्येक माउस से मस्तिष्क वर्गों को 5 श्रृंखलाओं में एलीकोट किया जाता है, जिसका उपयोग 5 अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों के लिए किया जा सकता है।
  3. गोदाम
    1. क्रायोप्रोटेक्टेंट बफर (20% ग्लिसरॉल, 30% एथिलीन ग्लाइकोल, और 50% पीबीएस) से भरे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में प्रत्येक अच्छी तरह से अनुभागों को स्थानांतरित करने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें, और नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: छोटे ट्यूबों (1.5 mL) में संग्रहीत ये अनुभाग फ्रीजर में भौतिक स्थान बचा सकते हैं, और अनुभागों की अखंडता को कई महीनों तक संरक्षित किया जा सकता है।

3. नि: शुल्क फ्लोटिंग WFA धुंधला और विरोधी AVP immunostaining

  1. पीबीएस से भरे 6-वेल सेल कल्चर प्लेट के कुएं में एक सेल छलनी रखें, और सेल छलनी में मस्तिष्क वर्गों की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें। पीबीएस के साथ एक और अच्छी तरह से भरा करने के लिए सेल छलनी स्थानांतरित करके पीबीएस में वर्गों कुल्ला। क्रायोप्रोटेक्टेंट बफर में संग्रहीत अनुभागों के लिए एक शेकर पर 6 x 10 मिनट के लिए कुल्ला और ताजा कटौती वर्गों के लिए 3 x 10 मिनट।
    नोट: सभी धोने की प्रक्रियाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से अंदर एक सेल छलनी के साथ एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक छलनी प्रत्येक माउस से ब्याज के मस्तिष्क वर्गों रखती है। अभिकर्मकों को बचाने के लिए, नीचे वर्णित सभी इनक्यूबेशन प्रक्रियाओं को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में किया जाता है। धोने और इनक्यूबेशन प्रक्रियाओं के बीच, प्रत्येक सेल छलनी और प्रत्येक ट्यूब के बीच मस्तिष्क वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें। पीबीएस के साथ धोने के लिए, प्रत्येक कुएं के लिए 12 एमएल पर्याप्त है।
  2. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीटी (1,000 एमएल में 1,000 एमएल) बफर (पीबीएस के 1,000 एमएल में भंग ट्राइटन एक्स -100 के 2.5 मिलीलीटर) बफर में बायोटिन-लेबल वाले डब्ल्यूएफए (1: 1,000) समाधान के 1 एमएल तैयार करें। सेल छलनी से ट्यूब के लिए मस्तिष्क वर्गों हस्तांतरण और एक रॉकिंग मंच ~ 50 आरपीएम पर कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट.
  3. 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों कुल्ला के रूप में 3.1 में वर्णित है.
  4. एक 1.5 mL ट्यूब में PBT में स्ट्रेप्टाविडिन-Dylight 488 (1:500) समाधान के 1 mL तैयार करें। ट्यूब में मस्तिष्क वर्गों को स्थानांतरित करें और ~ 50 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफ़ॉर्म पर 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस कदम से आगे प्रकाश जोखिम से बचने के लिए पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें।
  5. 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों कुल्ला। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए बफर (पीबीटी में पतला 3% सामान्य गधा सीरम) को अवरुद्ध करने में मस्तिष्क वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सीरम को अवरुद्ध करने का विकल्प उन प्रजातियों द्वारा निर्धारित किया जाता है जिनसे द्वितीयक एंटीबॉडी उत्पन्न होती है। उदाहरण के लिए, यदि द्वितीयक एंटीबॉडी बकरी से है, तो सामान्य बकरी सीरम का उपयोग किया जाना चाहिए।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी AVP, 1: 500) में मस्तिष्क वर्गों को रात भर में ~ 50 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफ़ॉर्म पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट:: दोनों प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को अवरोधित बफ़र में तैयार करें। इनक्यूबेशन की एकाग्रता, अवधि, और इनक्यूबेशन के तापमान को पायलट अध्ययन में अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
  7. 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों कुल्ला। द्वितीयक एंटीबॉडी (एलेक्सा आटा 594 गधा विरोधी खरगोश IgG (एच + एल), 1: 500) में मस्तिष्क वर्गों को ~ 50 आरपीएम पर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों कुल्ला।

4. बढ़ते

  1. दो पेट्री व्यंजन (150 मिमी का व्यास) 1x पीबीएस प्रत्येक के 100 मिलीलीटर के साथ भरें। एक छलनी से सभी मस्तिष्क वर्गों को पहले पकवान में स्थानांतरित करें, और मस्तिष्क वर्गों को न्यूरोएनाटॉमिकल क्रम में पुच्छल से रोस्ट्रल तक संरेखित करें।
    नोट: विभिन्न जानवरों से वर्गों के मिश्रण से बचने के लिए, एक समय में एक जानवर से मस्तिष्क वर्गों की एक श्रृंखला माउंट करें।
  2. सभी मस्तिष्क वर्गों को पहले पकवान में संरेखित करने के बाद, एक स्लाइड को दूसरे डिश में डुबोएं, जिसमें एक छोर थोड़ा सा एक स्टैंड के साथ झुका हुआ है ( चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें)। झुका हुआ स्लाइड पर एयर-बफर इंटरफ़ेस के ठीक नीचे एक मस्तिष्क अनुभाग को धीरे से रखने के लिए एक ठीक पेंटब्रश का उपयोग करें। एक अन्य मस्तिष्क अनुभाग के साथ एक ही प्रक्रिया को दोहराएं और इसे पहले अनुभाग के साथ कंधे से कंधा मिलाकर माउंट करें।
  3. धीरे-धीरे और धीरे-धीरे बफर को हटाने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें ताकि इसके स्तर को कम किया जा सके जब तक कि दोनों मस्तिष्क अनुभाग पूरी तरह से एयर-बफर इंटरफ़ेस से ऊपर न हों।
    नोट: बफर सतह की गड़बड़ी को कम करने के लिए ध्यान रखें, या मस्तिष्क अनुभाग दूर तैर सकते हैं। जब सूखा होता है, तो मस्तिष्क वर्गों की यह पंक्ति स्लाइड का दृढ़ता से पालन करेगी। यदि आवश्यक हो, तो धीरे-धीरे स्लाइड पर अनुभागों को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जब अनुभाग अभी भी गीले होते हैं तो ऊतक में कोई झुर्रियां या सिलवटें नहीं होती हैं।
  4. इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि स्लाइड के निचले भाग तक नहीं पहुंच जाता. तब तक दोहराना जारी रखें जब तक कि सभी अनुभाग स्लाइड (स्लाइड्स) पर माउंट न हों.

5. कवर्सिंग

  1. सभी वर्गों के सूखने के बाद (कमरे के तापमान पर 1-24 घंटे), स्लाइड पर DAPI ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एंटी-लुप्त होती बढ़ती माध्यम के 80-100 μL रखें, और नमूनों को कवर करने के लिए धीरे से एक ग्लास कवरस्लिप लागू करें।
    नोट: बुलबुले से बचने के लिए ग्लास कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे लागू करें।
  2. स्लाइड्स को माइक्रोस्कोप स्लाइड बॉक्स में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    नोट: प्रतिदीप्ति के लुप्त होने और autofluorescence के विकास से बचने के लिए 1-3 दिनों के भीतर सभी वर्गों छवि।

6. इमेजिंग

  1. स्कैनर और कंप्यूटर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें). स्लाइड्स को लोडिंग डिवाइस के साथ स्लाइड होल्डर में रखें और स्कैनर में धारक डालें।
    नोट: स्कैनर एक साथ कई चैनलों (जैसे, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), हरे, और लाल चैनलों) की स्कैनिंग सक्षम बनाता है। स्कैनर केवल 20x आवर्धन के साथ स्लाइड को स्कैन करता है, और एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग तब किया जा सकता है जब उच्च आवर्धन (जैसे, 40x) की आवश्यकता होती है।
  2. स्कैनर के लिए सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। उपयुक्त संग्रहण स्थान और स्कैनिंग प्रोफ़ाइल चुनें.
  3. पूर्वावलोकन स्कैन प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करके पूर्वावलोकन स्कैन प्रारंभ करें . पूर्वावलोकन स्कैन के बाद, ऊतक का पता लगाने विज़ार्ड खोलें और इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्रों को सर्कल करें।
  4. इमेजिंग के लिए क्षेत्रों को चुनने के बाद स्टार्ट स्कैन बटन पर क्लिक करें। मशीन स्कैनिंग समाप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें। परिणाम फ़ाइल की जाँच करें और छवियों को निर्यात करें।
    नोट:: यदि प्रोफ़ाइल स्लाइड के लिए अनुपयुक्त है, तो ऊतकों के लिए प्रोफ़ाइल को अनुकूलित करने के लिए एक्सपोज़र समय या प्रकाश शक्ति को पुन: केंद्रित और परिवर्तित करके समायोजित करें। अधिक तकनीकी विवरण (सामग्री की तालिका) के लिए स्कैनर के लिए निर्देशों को देखें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के प्रवाह चार्ट को संक्षेप में चित्र 1 में चित्रित किया गया है। इस प्रयोगशाला की क्रायोसेक्शनिंग प्रक्रिया को चित्रा 2 ए में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें 5 मस्तिष्क के नमूनों को एक साथ विभाजित किया गया था। मस्तिष्क वर्गों के बढ़ते चित्र 2B में दिखाया गया है, और मस्तिष्क वर्गों के साथ एक पूरी तरह से घुड़सवार स्लाइड चित्र 2C में सचित्र है। चित्रा 3 में, एक माउस मस्तिष्क अनुभाग की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियां WFA और AVP के सह-धुंधला होने के साथ Bregma -0.82 मिमी पर कम और उच्च आवर्धन पर AVP संकेतों को पैरावेंट्रिकुलर नाभिक और सुपरोप्टिक नाभिक में देखा गया था। WFA संकेतों पूर्वकाल हाइपोथैलेमस और रेटिकुलर नाभिक के पेरिफोर्निकल क्षेत्र में देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: माउस दिमाग के साथ प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का फ्लो चार्ट। पूर्ण संज्ञाहरण के बाद, एक माउस को खारा और फिर 10% एनबीएफ के साथ परफ्यूज किया जाता है। मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है और निर्धारण और निर्जलीकरण के बाद वर्गों में काट दिया जाता है। अनुभागों को WFA के साथ incubated किया गया था, जिसके बाद पीबीएस के साथ तीन धोने के बाद स्ट्रेप्टाविडिन-डायलाइट 488 था। मस्तिष्क वर्गों को अवरुद्ध कर दिया गया था और फिर प्राथमिक एंटी-एवीपी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। फिर, वर्गों को पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया था, इसके बाद माध्यमिक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लोर 594 गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) के साथ इनक्यूबेशन किया गया था। मस्तिष्क वर्गों को स्लाइड पर रखा गया था और इमेजिंग से पहले DAPI के साथ एंटीफैडिंग बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड पर रखा कवरस्लिप। संक्षेप: NBF = तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन; WFA = Wisteria florbunda agglutinin; PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा; एवीपी = arginine vasopressin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगशाला में व्यावहारिक क्रायोसेक्शनिंग और बढ़ते हुए तस्वीरें। (ए) सभी नमूनों को क्षैतिज रूप से रखने के लिए 30% सुक्रोज के साथ प्लेट के शीर्ष पर एक आधार का निर्माण करें, ऊतकों को वर्गों (25 μm / अनुभाग) में काटें और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा से भरे 48-वेल सेल कल्चर प्लेट में वर्गों को इकट्ठा करें। (बी) एक स्टैंड के साथ थोड़ा झुका हुआ एक छोर के साथ पकवान में एक स्लाइड डुबोएं। एयर-बफ़र इंटरफ़ेस के तहत अनुभागों की प्रत्येक पंक्ति रखें और स्लाइड के निचले भाग तक अनुभागों को बफ़र से बाहर लाने के लिए बफ़र को कम करें. सफेद रेखा बफर और हवा के इंटरफ़ेस को इंगित करती है। (सी) मस्तिष्क वर्गों के साथ एक पूरी तरह से घुड़सवार स्लाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डबल immunofluorescence धुंधला का एक उदाहरण (ए-डी) माइक्रोस्कोपिक छवियों WFA (लाल, ए), एवीपी (हरे, बी), DAPI (नीले, सी), और विलय (डी) के वितरण को दर्शाते हुए कोरोनल माउस मस्तिष्क वर्गों में Bregma -0.82 मिमी पर. स्केल सलाखों = 200 μm. (E-H) A-D में सफेद बक्से की उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपिक छवियां, क्रमशः। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त रूप: 3V = तीसरा वेंट्रिकल; PeFAH = पूर्वकाल हाइपोथैलेमस के पेरिफॉर्निकल क्षेत्र; PVH = पैरावेंट्रिकुलर नाभिक; RT = reticular नाभिक; SON = supraoptic nucleus कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के न्यूरोएनाटॉमिकल अध्ययन के लिए एक स्थापित विधि प्रदान करता है, जिसमें परफ्यूजन, ऊतक सेक्शनिंग, फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग, ऊतक माउंटिंग और इमेजिंग शामिल हैं। हालांकि, सुसंगत और विश्वसनीय परिणामों के लिए आवश्यक कुछ महत्वपूर्ण विवरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

परफ्यूजन की गुणवत्ता सफल धुंधला होने के लिए महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क में रक्त बने रहने पर धुंधला परिणाम प्रभावित हो सकते हैं, यह देखते हुए कि रक्त कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, लाल रक्त कोशिकाएं) एक कृत्रिम 'सकारात्मक' धुंधला उत्पन्न कर सकती हैं। हम परफ्यूजन की उच्च गुणवत्ता को इंगित करने के लिए एक भूरे-भूरे रंग के जिगर की उपस्थिति का अनुमान लगाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर रक्त मुक्त दिमाग होता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला स्वचालित परफ्यूजन पंप एक छोटी अवधि के भीतर एक जानवर को सफलतापूर्वक पारफ्यूज करने में मदद करता है। अपर्याप्त निर्धारण बाद की प्रक्रियाओं में नरम और नाजुक मस्तिष्क वर्गों को उत्पन्न करेगा, जबकि अधिक निर्धारण प्रोटीन के बढ़े हुए फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉस-लिंकिंग के कारण एंटीजन प्रतिक्रियाओं की संवेदनशीलता को कम करेगा। विभिन्न स्थितियों का परीक्षण किया गया था, और माउस दिमाग के पोस्ट-फिक्सेशन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर का निर्धारण पर्याप्त था। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक फिक्सेटिव बफर के रूप में उपयोग किए जाने वाले 10% एनबीएफ के अलावा, पीबीएस में ताजा तैयार पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 4% (डब्ल्यू / वी) का भी ऊतक निर्धारण के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है।

क्रायोसेक्शनिंग के बारे में, वर्गों की मोटाई को विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर तय करने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, आरएनएस्कोप अध्ययनों के लिए 25 μm के बजाय 14 μm की मोटाई की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर फ्री-फ्लोटिंग स्टेनिंग में उपयोग किया जाता है। इस बीच, आरएनएस्कोप अध्ययनों की आवश्यकता है कि लक्ष्य एमआरएनए की अखंडता को संरक्षित करने के लिए सभी प्रक्रियाओं को आरएनएएस-मुक्त समाधानों में किया जाता है। कुछ शोधकर्ता विभिन्न प्रकार की धुंधला प्रक्रियाओं के लिए 30-40 μm की एक अनुभाग मोटाई का भी उपयोग करते हैं। पारंपरिक क्रायोसेक्शनिंग (यानी, इष्टतम काटने का तापमान (O.C.T.) यौगिक-एम्बेडेड नमूने) बहुत पतले (जैसे, 10 μm) मस्तिष्क वर्गों के लिए अनुमति देता है जो इंट्रासेल्युलर संरचनाओं या अन्य अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत क्रायोसेक्शनिंग रणनीति में आवश्यक रूप से मस्तिष्क के नमूनों के ओ.C टी यौगिक-एम्बेडिंग शामिल नहीं है और 14-40 μm वर्गों के लिए अनुमति देता है। 25 या 40 μm मोटे मस्तिष्क वर्गों का उपयोग करके 3,3-diaminobenzidine (DAB) धुंधला के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हो सकता है। हालांकि, पतले अनुभाग बेहतर गुणवत्ता वाले प्रतिदीप्ति छवियों की पेशकश करते हैं।

यहां प्रस्तुत रणनीति का लाभ यह है कि कई मस्तिष्क के नमूने (5 दिमाग तक) एक समय में काटे जा सकते हैं। हालांकि, इस विधि की सीमा यह है कि निर्जलीकरण के बाद मस्तिष्क के नमूनों को 1 सप्ताह के भीतर काटने की आवश्यकता होती है क्योंकि बहुत लंबे समय तक 30% सुक्रोज में पनडुब्बी प्रोटीन क्षरण और अन्य मुद्दों का कारण बनने की अधिक संभावना है। इस संभावित मुद्दे से बचने के लिए, इन मस्तिष्क वर्गों को क्रायोप्रोटेक्टेंट बफर में स्थानांतरित किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। फ्री-फ्लोटिंग स्टेनिंग के लिए, इनक्यूबेशन की अवधि और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों की एकाग्रता को पायलट अध्ययन में अनुकूलित किया जाना चाहिए। आम तौर पर, रात भर इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस या हल्के झटकों के साथ कमरे के तापमान पर अधिकांश प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है, यदि निर्माताओं द्वारा अन्यथा निर्देश नहीं दिया जाता है। माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, 1-3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन ज्यादातर स्थितियों में अच्छी तरह से काम करता है। हालांकि, इन विवरणों को विभिन्न परिस्थितियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, सी-फॉस स्टेनिंग के लिए, हम आमतौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर 1: 1,000 की एकाग्रता के साथ मस्तिष्क वर्गों को इनक्यूबेट करते हैं। हालांकि, सी-फॉस डीएबी स्टेनिंग के लिए एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हम 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 1: 5,000 की एकाग्रता के साथ मस्तिष्क वर्गों को इनक्यूबेट करना पसंद करते हैं।

प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग प्रक्रिया को गति देने के लिए डबल-स्टेनिंग के लिए किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, विभिन्न प्रजातियों से दो अलग-अलग प्राथमिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, एक खरगोश से है, दूसरा गिनी पिग, चिकन या माउस से है) को इनक्यूबेशन से पहले मिश्रित किया जाता है, जैसा कि संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी हैं। द्वितीयक एंटीबॉडी का विकल्प प्राथमिक एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। यदि प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश से है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश होना चाहिए, उदाहरण के लिए, गधा विरोधी खरगोश या बकरी विरोधी खरगोश। सीरम को अवरुद्ध करने का चयन द्वितीयक एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, सामान्य गधे सीरम का उपयोग किया जाएगा यदि द्वितीयक एंटीबॉडी गधे से है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति का सुझाव दिया जाता है यदि इम्यूनोस्टेनिंग अभी भी काम नहीं करता है, भले ही सभी दिशानिर्देशों का सख्ती से पालन किया गया हो।

बढ़ते और मस्तिष्क वर्गों के आवरण एक बहुत ही नाजुक तरीके से प्रदर्शन किया जाना चाहिए. पूरी प्रक्रिया के लिए कोई झुर्रियों, सिलवटों, या हवा के बुलबुले की आवश्यकता नहीं होती है। इमेजिंग के लिए इष्टतम एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के लिए कई परीक्षण लगेंगे। हम विभिन्न वर्गों में एक ही एंटीबॉडी के लिए एक ही एक्सपोजर समय की सिफारिश करते हैं, जो विभिन्न जानवरों या समूहों के बीच सिग्नल तीव्रता की तुलना करने के लिए आवश्यक है। यह उचित है कि एक्सपोज़र समय विभिन्न एंटीबॉडी के लिए समान नहीं हो सकता है, यहां तक कि एक ही अनुभाग में भी। उदाहरण के लिए, DAPI के लिए एक्सपोज़र समय ज्यादातर मामलों में c-fos सिग्नल से कम हो सकता है।

प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कुछ प्रक्रियाएं पूरी प्रक्रिया में विश्वसनीयता और दक्षता दोनों में सुधार करने में सहायक हैं। 1) परफ्यूजन के लिए एक स्वचालित परफ्यूजन पंप का उपयोग करना परफ्यूजन समय को काफी कम कर सकता है और ऊतक की गुणवत्ता में काफी सुधार कर सकता है। 2) यह क्रायोसेक्शनिंग रणनीति एक साथ कई मस्तिष्क के नमूनों को टुकड़ा करने में सक्षम बनाती है, जो पारंपरिक अभ्यास की तुलना में बहुत अधिक कुशल है। यह विधि नए शोधकर्ताओं के लिए सीखने और मास्टर करने के लिए भी आसान है। 3) मुक्त-फ्लोटिंग स्टेनिंग के लिए, जैसा कि मस्तिष्क के नमूनों को निलंबन में दाग दिया जाता है, एंटीबॉडी दोनों पक्षों से वर्गों में प्रवेश कर सकते हैं। हमने प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एक नमूना / श्रृंखला से सभी वर्गों को रखकर इनक्यूबेशन रणनीति को अनुकूलित किया, जो एंटीबॉडी को बचाता है, खासकर जब हमें मस्तिष्क के नमूनों को थोक में दागने की आवश्यकता होती है। मुक्त-फ्लोटिंग दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि इसे संशोधित किया जा सकता है और अन्य हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग विधियों (जैसे, क्रोमोजेनिक आईएचसी, हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन, क्रेसिल वायलेट) पर लागू किया जा सकता है, इसके अलावा इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग 12।

हालांकि, फ्री-फ्लोटिंग स्टेनिंग की एक सीमा यह है कि बहुत पतले वर्गों को संभालना मुश्किल हो सकता है। एक ऑन-स्लाइड स्टेनिंग विधि पर विचार किया जा सकता है यदि केवल कुछ वर्गों को तुरंत एकत्र करने और दागने की आवश्यकता होती है, जैसा कि अक्सर नैदानिक विकृति विज्ञान में होता है। हमने इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न मस्तिष्क वर्गों का उपयोग करके ऑन-स्लाइड स्टेनिंग विधि का भी परीक्षण किया, और यह अच्छी तरह से काम किया। ऐसा करने के लिए, मस्तिष्क अनुभागों को स्लाइड पर माउंट करें, अनुभागों के सूखने की प्रतीक्षा करें, और एक पारंपरिक जमे हुए अनुभाग ऑन-स्लाइड स्टेनिंग प्रोटोकॉल का पालन करें। 4) स्लाइड पर बढ़ते फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन कुछ शोधकर्ताओं के लिए थकाऊ हो सकते हैं, खासकर शुरुआती लोगों के लिए। हम एयर-बफर इंटरफ़ेस पर स्लाइड पर धीरे-धीरे अनुभागों को मनाने के लिए एक ठीक पेंटब्रश का उपयोग करते हैं और फिर स्लाइड के शीर्ष से नीचे तक बढ़ते अग्रिमों के रूप में एयर-बफर इंटरफ़ेस को कम करने के लिए बफर को धीरे से हटाने के लिए एक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करते हैं। हालांकि समय लेने वाली, यह रणनीति शुरुआती लोगों के लिए अनुकूल है। अनुभवी प्रयोगकर्ता एक समय में पीबीएस में स्लाइड पर सभी दिमाग वर्गों को माउंट कर सकते हैं और केवल अंतिम अनुभाग के बाद स्लाइड को बाहर लाने के लिए बफर को हटा सकते हैं। 5) अंत में, हम इमेजिंग के लिए एक स्कैनर का उपयोग करते हैं, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक कुशल है, खासकर जब इमेजिंग के लिए बड़ी संख्या में स्लाइड्स हों। स्कैनर 20x आवर्धन के साथ एक बैच में 12 स्लाइड तक स्कैन करने में सक्षम बनाता है। वैकल्पिक रूप से, मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को कुछ परिस्थितियों में नियोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जब मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के एक विशिष्ट क्लस्टर को उच्च आवर्धन (उदाहरण के लिए, 40x या यहां तक कि 60x) 13,14 के साथ प्रदर्शित किया जाना चाहिए।

अंत में, यह पेपर माउस दिमाग के हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक स्थापित पद्धति प्रस्तुत करता है जो पुनरुत्पादक, विश्वसनीय और कुशल साबित हुआ है। प्रोटोकॉल विभिन्न शोधकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच इष्टतम और सुसंगत हिस्टोलॉजिकल परिणाम उत्पन्न करने में मदद करेगा और इस तकनीक को सीखने के लिए शुरुआती लोगों के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

जांचकर्ताओं को एनआईएच (K01DK119471 से CW को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, और R01DK120858 YX के लिए), USDA / CRIS (YX के लिए 51000-064-01S), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (# 829565) LT करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
माउस दिमाग के मुक्त फ्लोटिंग Immunostaining
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Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

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