تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

هذا البروتوكول مهم لأنه يوضح طريقة إصابة الدماغ المركزية التي تؤدي إلى تكوين الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا ، حيث لا يوجد عادة. نتوقع أن استخدام هذه التقنية لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الأعصاب الكبار ستكون ذات صلة للتجديد العصبي البشري. تعلم هذه التقنية يتطلب الصبر والمثابرة.

نوصي بممارسة الرياضة على خمسة إلى عشرة أدمغة يوميا لعدة أسابيع قبل جمع الأدمغة للتحليل. بعد تخدير الذباب على وسادة ثاني أكسيد الكربون. فرز eclosed حديثا F1 الذباب الذكور الشباب في غضون ست ساعات من الانفجار ووضعها في قوارير نظيفة تحتوي على المواد الغذائية مع 40 أو أقل الذباب لكل قارورة.

إذا كان التخطيط لتسمية الخلايا الفاصلة مع EdU إعداد 200 ميكرولتر من 50 مطحنة أو أكثر EdU في 10٪ السكروز ووضع الحل المعد على ورقة تصفية 23 ملليمتر الجولة الثالثة في قارورة فارغة، ثم وضع الذباب الذكور في القارورة للتغذية المسبقة قبل ست ساعات من الإصابة. بعد ذلك، تعقيم دبابيس مينوتين عن طريق وضع ما يقرب من 100 دبابيس في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر مليئة 70٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق. ثم تعقيم لوحة ثاني أكسيد الكربون وفرشاة الطلاء عن طريق رش الإيثانول 70٪ ومسح الجافة مع الأنسجة النظيفة خالية من الوبر.

بمجرد تنظيف الأدوات وجفافها ، قم بنقل 40 أو أقل من الذكور F1 المفرزين على اللوحة النظيفة وفصلهم إلى مجموعتين. مجموعة واحدة ستكون بمثابة الذباب غير المصاب السيطرة. والمجموعة التجريبية الثانية ستخضع لإصابة دماغية صادمة

بعد ذلك ، باستخدام ملقط سحب أربعة إلى خمسة دبابيس مينوتين جديدة من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة ووضعها بالقرب من حافة لوحة ثاني أكسيد الكربون. ثم تحت نطاق تشريح اختيار دبوس Minutien على التوالي مع نقطة حادة. أعد استخدام الدبابيس الحادة وضع دبابيس تالفة أو حادة في أنبوب منفصل يحتوي على 70٪ من الإيثانول للتخلص الآمن.

بعد ذلك ، بالنسبة للذباب مع مفتاح النمط الجيني القياسي على مصباح LED المجهر ستيريو مجهزة مرشحات الإثارة والانبعاثات المناسبة للبروتين الفلوري الأخضر الذي يسمح الإثارة في 440 إلى 460 نانومتر ويسمح التصور في 500 إلى 560 نانومتر. ثم اختر ذبابة المجموعة التجريبية ووضع ذبابة بحيث المجرب لديه وجهة نظر ظهرية من كبسولة الرأس مع رئيس الذباب إلى اليمين. باستخدام ملقط التقاط وعقد دبوس مينوتين المحدد في يد واحدة، وفرشاة الطلاء في اليد الأخرى.

ثم ضع الفرشاة على الجزء الأمامي من الصدر الظهري وادفع لأسفل بلطف لتثبيت الذبابة. تهدف طرف دبوس مينوتين في أجسام الخلايا فطر الهيئات على الجانب الأيمن من الرأس واختراق كبسولة الرأس. إذا كان استخدام المعالم يستهدف قطع الرأس الظهرية بين الocelli والحافة الظهرية للعين.

بعد الانتهاء من الإصابة، استخدم فرشاة الطلاء لدفع الرأس بلطف من دبوس مينوتين. إذا كان استخدام الدماغ لتسلسل الحمض النووي الريبي أو QRT PCR تجعلنا إصابة ثانية على الجانب الأيسر من الرأس. مرة واحدة وقد أصيب جميع الذباب التجريبية مكان السيطرة والذباب المصاب في قوارير منفصلة وصفت تحتوي على الغذاء.

وضع قوارير أفقيا لمنع الذباب من الوقوع في الطعام. ضع الذباب الصلب القياسي عند 25 درجة مئوية ويطير البيرماوين عند 30 درجة مئوية إلى العمر. إذا الشيخوخة أطول من 24 ساعة نقل الذباب على الغذاء النظيف كل يوم إلى يومين.

ولوحظت زيادة كبيرة في الانتشار بعد 24 ساعة من الإصابة باستخدام مضاد لhH3 علامة للخلايا التي تمر بنشاط الانقسام. ويلاحظ ما يقرب من ثلاث خلايا إيجابية pH3 في كل من العقول المركزية السيطرة. و11 خلية إيجابية من نوع PH3 في كل من الأدمغة المركزية المصابة.

بحلول سبعة أيام، ما معدله 2 خلايا إيجابية EdU موجودة في كل من أدمغة الخلية التحكم. و 11 خلايا إيجابية EdU في كل من العقول المركزية المصابة، وهو ما يشبه النتائج التي تم الحصول عليها 24 ساعة بعد الإصابة مع الأجسام المضادة pH3. في 14 يوما الضوابط بلغ متوسط خلية إيجابية EdU واحد لكل الدماغ المركزي، والأدمغة المصابة بلغ متوسط 29 خلايا إيجابية EdU لكل الدماغ المركزي.

مما يدل على أن انتشار الخلايا يستمر على الأقل في الأسبوع الثاني بعد إصابة الدماغ الرضية اختراق. ويلاحظ أقوى استجابة التكاثر في الدماغ المركزي عندما يصاب الأدمغة في غضون الساعات ال 24 الأولى بعد انهيار الدماغ. وبحلول سبعة أيام بعد الانهيار، لا تزال الإصابة المخترقة تسبب زيادة كبيرة في الانتشار.

ومع ذلك ، بحلول 14 يوما ، تنخفض قدرة الخلايا على الانقسام بشكل كبير إلى خلية واحدة مقسمة لكل دماغ. وهو مشابه لتلك التي من السيطرة على العقول. وباستخدام نظام وضع العلامات على البيرماتين، تم الكشف عن المزيد من استنساخ البيرماتين في عينات مصابة في يومين، في غضون أسبوعين، مقارنة بالضوابط.

مع تزايد عدد المستنسخين مع مرور الوقت بعد الإصابة. بعد أسبوعين من الإصابة كانت هناك خلايا عصبية جديدة لجسم الفطر في 50٪ من الأدمغة المصابة. هذه الخلايا العصبية الجديدة المتوقعة dendrites ما يقرب من calyx الجسم الفطر، والمؤشر إلى فصوص الجسم الفطر.

وتشمل المناطق الأخرى من الدماغ التي يبدو أنها تتجدد فصوص هوائي الجسم الإهليلجي والقرن الجانبي. تأكد من استخدام دبوس Minutien حادة عند القيام إصابات الدماغ واستخدام دبوس مملة أو عازمة سوف تزيد من معدل الوفيات. تأكد أيضا من عدم الضغط بقوة على الذباب مع فرشاة الطلاء لأن هذا سيزيد أيضا من معدل الوفيات.

بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام الكيمياء المناعية لقياس الانتشار الذاتي وأيضا لتحديد الخلايا العصبية الجديدة والغليا.